13 載脂蛋白E基因檢測標準操作流程

載脂蛋白E基因多態(tài)性檢測標準操作規(guī)程一、檢驗目的為保證本實驗室檢測載脂蛋白E(ApoE)基因型時DNA提取、PCR擴增及擴增產(chǎn)物雜交、顯色、芯片掃描實驗操作的標準化，確保檢測結果的準確性、重復性，制定本規(guī)程。二、適用范圍適用于血液樣本基因組DNA的提取、PCR擴增、雜交顯色及報告。三、方法原理采用基因芯片技術，測序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探針。當溶液中帶有熒光標記的核酸序列TATGCAATCTAG,與基因芯片上對應位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時，通過確定熒光強度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列，據(jù)此可重組出靶核酸的序列。載脂蛋白E(ApoE)是一種由299個氨基酸殘基組成的蛋白質，與脂質轉運和代謝密切相關，參與眾多疾病的發(fā)生、發(fā)展和預后。其生理和病理功能的體現(xiàn)，主要取決于氨基酸殘基的差異，而不是血清中ApoE含量的高低。ApoE基因共有三個等位基因，分別為&2、&3和&4,并由此組合成6種基因型，即ApoE&2/2、&3/3、&4/4三種純合子和ApoE&2/3、&2/4、&3/4三種雜合子°ApoE通過其與受體結合，決定了乳糜微粒(CM)、低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDLs)、高密度脂蛋白(HDL)等脂質的降解，在脂蛋白代謝中發(fā)揮著重要的作用，其代謝和降解的速率，直接與APOE與其受體的親合能力有關。不同的ApoE基因型與相應的配體具有完全不同的親合力，不同型間的差異高達100倍，進而對CM、VLDLs和HDL的分解代謝形成完全不同的影響。&2與LDL受體親結合力最低，因而&2等位基因攜帶者其血液中總膽固醇(TC)、LDL-C濃度低，易患III型高脂血癥；&4與LDL受體親合力最高，因而&4等位基因攜帶者其血液中TC、LDL-C濃度高，易患冠心病、腦梗死、阿爾茲海默癥等疾病。由于ApoE基因型別的不同，影響了系列疾病的發(fā)生風險及預防保健方式。因此，早期檢測ApoE基因型，將有助于我們終身的疾病預防和健康管理。四、性能指標最低檢出限：2ng/ul基因組DNA。準確度：以濃度為50-70ng/ul的&2/2、&3/3、&4/4和ApoE&2/3、&2/4、&3/4各3種基因型的DNA樣品分別檢測試劑盒，結果符合相應型別；以10份企業(yè)標化的陰性質控品進行平行兩次檢測，結果一致且均為陰性；以6-10ng/ul的ApoE&2/3、&2/4、&3/4雜合基因型的DNA樣品分別檢測試劑盒，結果符合相應位點基因型別。2.精密度：以濃度為20-40ng/ul的ApoE&2/3、&2/4、&3/4雜合基因型的DNA樣品分別分別對同一批試劑盒平行檢測20次，每天4次，分為5天，檢測結果一致。五、標本收集標本類型：靜脈血的全血標本作為檢測標本(抗凝劑為EDTA，抗凝劑的質量應符合化試藥品要求——化學純或分析純，使用的比例以廠家推薦為準)。標本保存室溫保存不超過7天，2?8°C不超過1個月，-20°C不超過7周，反復凍融不超過5次，全血的運輸必須遵守國家相關規(guī)定。標本拒收與1、2所述不符的標本，檢驗人員應向臨床或就診者說明拒收標本的原因，并提出解決方案或建議，并做好相關記錄。試劑的分裝：擴增液(1、2、3)融溶后，將其分裝到0.2ml離心管中，22^1/管。試劑的貯存：擴增液、陽性對照液、陰性對照液2?8°C貯存不超過1周，-20°C可貯存至效期;反應液A在-20C貯存。各組分在-20C貯存期間，凍融次數(shù)不超過5次。擴增產(chǎn)物短時間內可于2-8C保存。六、試劑盒及儀器組成臺式高速離心機：離心速度能夠達到12,000rpm(9,500Xg)恒溫金屬浴或水浴箱(溫度范圍至少應包括56C)渦旋振蕩器移液器：規(guī)格為1ml、200山及100山紫外分光光度計：檢測波長范圍至少應涵蓋260nm及280nm血液基因組DNA提取試劑盒(這里以BaiO?DNA提取純化試劑盒為例)PCR儀：有熱蓋，使用0.2ml離心管臺式離心機(可以對0.2ml離心管瞬時離心)瓊脂糖凝膠電泳儀移液器：規(guī)格為100卩1,20卩1,2.5卩1BaiO?載脂蛋白E(ApoE)基因檢測試劑盒(PCR-芯片雜交法)移液器：規(guī)格為1ml,200卩1,10卩1BaiO?載脂蛋白E(ApoE)基因檢測試劑盒(PCR-芯片雜交法)BaiO?BR-526-24全自動雜交儀BaiO?BE-2.0生物芯片識讀儀BaiO?基因芯片圖像分析軟件BaiO?載脂蛋白e(ApoE)基因型分析軟件七、標本處理及擴增操作程序1、基因組DNA提取處理血液材料做載脂蛋白E(ApoE)基因型檢測時，只需用200卩1血液即可。當血液樣品體積小于200卩1時，可加適當體積PBS調整至200卩1再進行下一步實驗。活化吸附柱吸附柱在使用前需要活化，活化方法：將吸附柱置于收集管中，加入500卩1緩沖液BH1，靜置2-3min,12,000rpm(9,500xg)離心30s；棄去收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中，在吸附柱中加入500卩1緩沖液BH2,12,000rpm（9,500xg）離心30s,棄去收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中待用。1.3取1.5ml離心管，做好標記，每管中加入20口丨蛋白酶K溶液。1.4加入200口丨血液樣品（注意：在加入血液樣本之前一定要把全血充分混勻）。1.5加入200口丨緩沖液BL,振蕩15秒，混勻。低速離心，使管壁血液離心至底部（注意：不可將緩沖液BL直接加入蛋白酶K中）。1.656°C放置10分鐘。1.7加200口丨無水乙醇，振蕩15秒，混勻，低速離心。1.8將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個已活化的吸附柱中（吸附柱放入收集管中），不要弄濕管口，12,000rpm（9,500Xg）離心1min，棄去裝廢液的收集管，將吸附柱插入新的收集管中。1.9向吸附柱中加入500口丨緩沖液BW1（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），不要弄濕管口，12,000rpm（9,500Xg）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入500口丨緩沖液BW2（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），不要弄濕管口，12,000rpm（9,500Xg）離心1min，倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放入收集管中。將吸附柱放回收集管中，12,000rpm（9,500Xg）離心1min，以徹底去除吸附材料中殘余的漂洗液。將吸附柱轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加60口丨洗脫緩沖液BE，室溫（推薦56C）放置5min，12,000rpm（9,500Xg）離心1min，將溶液收集到離心管中。2、PCR擴增2.1取出原先分裝好的擴增液，在管內按照如下體系配制PCR反應液，并做好標記。每人份檢測使用1管擴增液1（22口丨/管）、1管擴增液2（22口丨/管）和1管擴增液3（22口丨/管）。擴增1：試劑體積（門基因組DNA

擴增液1反應液A221總體積25擴增2：試劑體積（卩1）基因組DNA2擴增液222反應液A1總體積25擴增3：試劑體積（卩1）基因組DNA2擴增液322反應液A1總體積252.2將各0.2ml離心管放入PCR儀中，按下列條件擴增：50°C5min；94°C5min；94°C30sec,59C30sec,72C30sec,35cycles；72C5min。2.3取出擴增產(chǎn)物，2?8°C保存。3、雜交顯色3.1取出BaiO?雜交顯色試劑盒。將反應液B低速離心，吸取10卩1加入雜交緩沖液瓶中混勻，備用。3.2配制雜交反應液：吸取170pl雜交緩沖液加入到8聯(lián)管中的對應位置，再向其中加入10卩l(xiāng)擴增1產(chǎn)物、10pl擴增2產(chǎn)物和10pl擴增3產(chǎn)物，混勻。3.3臨用前，取出1支抗體，低速離心，加入1ml抗體稀釋劑，振蕩混勻，制成抗體使用液，吸取200pl加入到8聯(lián)排管中的相應位置，剩余試劑-20°C保存。3.4向8聯(lián)排管中的相應位置加入200pl顯色液。3.5取出載脂蛋白E（ApoE）基因芯片，做好標記，將基因芯片（標簽面朝上）放入芯片卡槽內，確保芯片與溫控平臺平齊、貼緊，關上反應艙壓蓋。注意：芯片裝載時應平行插入，芯片裝載的位置編號須與試劑托架上對應的試劑管所放置編號一致。3.6將加好試劑的8聯(lián)排管逐一裝載在試劑托架上。注意：排管的裝載方向及編號，并保證裝載完畢后各8聯(lián)排管在同一高度上。3.7點擊“關閉"按鈕，關閉試劑艙。3.8點擊軟件運行窗口各區(qū)域（A/B/C）溫控狀態(tài)欄上的“加載"按鈕，載入“載脂蛋白E-41度.scri”程序，確認流程加載完畢，試劑及芯片也裝載正確后，點擊“運行”按鈕開始實驗。4、掃描4.1雜交反應結束后，取出芯片，用蒸餾水沖洗芯片表面，自然晾干。4.2啟動BE-2.0生物芯片識讀儀將計算機與本儀器各組件連接好后，打開儀器電源開關，此時掃描儀啟動4.3運行ArrayDoctor軟件掃描儀啟動1分鐘后，雙擊計算機桌面上的ArrayDoctor圖標，運行ArrayDoctor軟件。顯示屏出現(xiàn)ArrayDoctor軟件主頁面（下圖）。4.4放置芯片向下?lián)軇訖z測窗開啟按鈕，打開檢測窗蓋，將芯片欲掃描面（帶“BaiO”標簽面）朝上，平整的置于檢測窗的片槽內，注意，將有“BaiO”字樣標簽一

端朝開蓋的方向。輕輕閉合檢測窗蓋。4.5圖像掃描點擊工具欄右側的下拉列表框并選擇芯片種類，在芯片種類中選擇“載脂蛋白E(ApoE)基因檢測試劑盒”。b.單擊ArrayDoctor軟件工具欄上的“預掃描”按鈕，軟件自動開始預掃描并在計算機屏幕上輸出預掃描圖像和一個方框(下圖)c.用鼠標左鍵拖動方框至要掃描的區(qū)域d.單擊ArrayDoctor軟件工具欄上的“掃描”按鈕，掃描儀開始掃描，并將

待測圖像輸送至計算機屏幕（下圖）。4.6圖像分析a.用鼠標右鍵單擊圖像，出現(xiàn)一網(wǎng)框，用鼠標左鍵移動網(wǎng)框，使每個圓點處于一個網(wǎng)格中。點擊ArrayDoctor軟件工具欄上的“尋點”按鈕，各圓點被選中，如果發(fā)現(xiàn)因為背景信號使信號點選歪（罕見），可以用鼠標移動至正確位置。AzrayDoctorAzrayDoctor-c:Variaydsctor1BbipS.5:ViIMI?T打開雖掃摘另存為才點廿'I：'：Z5：1璋刃忙：；|：吃：貝：,_背|嘯?????OOO■?????ooo???ooo????e?ooo**???oooee?■??<weooo???oooooo???oooooo選點完成后單擊ArrayDoctor軟件工具欄上的“分析”按鈕，軟件將自動輸出檢測報告。4.7檢測圖像的保存分析完成后，點擊工具欄上的“保存”按鈕，可直接保存圖像。4.8檢測報告的保存和打印檢測報告為excel格式，對檢測報告的保存或打印可以在excel軟件中完成。八、實驗結果分析及判定ApoE基因共有三個等位基因，分別為&2、&3和&4,并由此組合成6種基因型，即ApoE&2/2、&3/3、￡4/4三種純合子和ApoE&2/3、&2/4、￡3/4三種雜合子oApoE通過其與受體結合，決定了乳糜微粒(CM)、低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDLs)、高密度脂蛋白(HDL)等脂質的降解，在脂蛋白代謝中發(fā)揮著重要的作用，其代謝和降解的速率，直接與APOE與其受體的親合能力有關。不同的ApoE基因型與相應的配體具有完全不同的親合力，不同型間的差異高達100倍，進而對CM、VLDLs和HDL的分解代謝形成完全不同的影響。&2與LDL受體親結合力最低，因而￡2等位基因攜帶者其血液中總膽固醇(TC)、LDL-C濃度低，易患III型高脂血癥；￡4與LDL受體親合力最高，因而￡4等位基因攜帶者其血液中TC、LDL-C濃度高，易患冠心病、腦梗死、阿爾茲海默癥等疾病。由于ApoE基因型別的不同，影響了系列疾病的發(fā)生風險及預防保健方式。因此，早期檢測ApoE基因型，將有助于我們終身的疾病預防和健康管理。九、室內質控及失控處理由于暫無室內質控來源，暫不設定室內質控物，由試劑盒自帶陽性對照代替。十、注意事項雜交顯色試劑盒(含抗體)、基因芯片2?8°C貯存，有效期12個月。反應液B在2?8°C貯存不超過1周，-20C貯存至有效期，凍融次數(shù)不超過5次。試劑的分裝：擴增液（1、2、3）融溶后，將其分裝到0.2m1離心管中，22卩1/管。試劑的貯存：擴增液、陽性對照液、陰性對照液2?8°C貯存不超過1周，-20°C可貯存至效期；反應液A在-20C貯存。各組分在-20C貯存期間，凍融次數(shù)不超過5次。擴增產(chǎn)物短時間內可于2-8C保存。PCR反應試劑的分裝、加樣應在一相對獨立試驗區(qū)域內進行，可與樣品DNA的提取在一個區(qū)域內進行，實驗進行時所需設備和試劑均應存于該區(qū)。樣本DNA的提取應在相對獨立試驗區(qū)域內進行，可與PCR反應的加樣在一個區(qū)域內進行，實驗進行時所需設備和試劑均應存于該區(qū)。PCR、芯片雜交顯色、掃描，及相關儀器試劑的存放應在另一個相對獨立區(qū)中進行。各區(qū)的移液器、槍頭、離心管不可互換使用，防止交叉污染。進入雜交區(qū)的人員應避免再次進入DNA提取及PCR加樣區(qū)。血液基因組DNA提取試劑在室溫（15-25C）干燥條件下，可保存12個月；更長時間的保存可置于2-8C。若緩沖液BL中有沉淀，可在56C水浴中重新溶解，搖勻后使用。使用前請先在緩沖液BW1和緩沖液BW2中加入適量無水乙醇，加入體積請參照瓶上標簽。提取的基因組DNA應保存在-20°C。十一、參考范圍暫無十二、質量控制1.DNA片段可用紫外分光光度計檢測DNA濃度及純度，DNA應在OD260處有顯著吸收峰，OD26o/OD28o的比值應為1.5-2.0。OD260值為1相當于大約50yg/ml雙鏈DNA。DNA濃度應在10-60ng/y1為宜。2?在做PCR實驗時可設置陽性對照和陰性對照［載脂蛋白E（ApoE）基因檢測試劑盒（PCR-芯片雜交法）附帶］,PCR反應后可將擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，陰性對照應檢測不出DNA，陽性對照應檢測出較明顯的DNA條帶，且在后面的雜交實驗中會檢測出該陽性對照基因型。芯片上陣列內每個探針重復次數(shù)為6個點。在正常檢測條件下，樣點形狀規(guī)則，無明顯拖尾。如遇檢測結果陰性，必須重復檢測。檢測中質控探針應為陽性，否則應檢查雜交顯色操作是否正確。如操作正確，請與試劑供應商聯(lián)系。對首次使用本試劑盒的實驗室和實驗人員，應進行陽性對照品和陰性對照品實驗，以確保實驗條件和操作符合要求。正常檢測時，也應定期進行陽性對照品和陰性對照品實驗。陽性對照使用方法：取陽性對照作為樣品DNA溶液，按照PCR到雜交顯色步驟進行操作。8?陰性對照使用方法：取陰性對照作為樣品DNA溶液，按照上述雜交步驟進行操作。檢測結果應為“未檢出”。十三、臨床意義1、ApoE基因型與心腦血管疾病冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。–HD）成為導致我國人群死亡的主要疾病之一，心肌梗死（Ml）是CHD中最嚴重的一型，嚴重危害人們的生活、健康和壽命。高脂血癥是其發(fā)生的重要危險因素。載脂蛋白E（ApoE）作為多種脂蛋白的結構成分，具有明顯的基因遺傳多態(tài)性，其參與脂類的運轉和代謝，與脂代謝紊亂、CHD和動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展危險性密切相關.ApoE4是早發(fā)性CHD發(fā)病的獨立危險因素，Meta分析表明，ApoE4攜帶者比不帶ApoE4者患CHD的危險性顯著增加。&2等位基因的平均影響是降低膽固醇濃度，而且“降膽固醇作用”是&4的“升膽固醇作用”的2-3倍，表明&2有保護人群不患冠心病的傾向。在冠心病患者中，&4等位基因頻率明顯高于正常組，早發(fā)CHD患者（＜50歲）的&4等位基因頻率比遲發(fā)者（＞50歲）更為增高。2、ApoE基因型與老年癡呆Coder等在1994年闡述了ApoE4的遺傳劑量與FAD的關系，他們認為每多遺傳一個ApoE4的等位基因，相應就增加了45%的AD的患病危險，也使得其發(fā)病年齡提前。在晚發(fā)型FAD中，每個ApoE4的等位基因能將發(fā)病年齡提前7-9年。他們的研究還表明ApoE2等位基因有降低AD發(fā)病風險以及延緩發(fā)病時間的作用。經(jīng)眾多研究者統(tǒng)計,AD患者中Apo