基于y-sr復合擴增技術的amely缺失男性個體ss位點檢測

基于y-sr復合擴增技術的amely缺失男性個體ss位點檢測

y染色體的短串聯(lián)重復序列（y-mrr）對血液評估非常重要。然而，Y-STRs的無效擴增已在各種人群中廣泛報道，如DYS393,DYS19等。另外，Y染色體上的蛋白質(zhì)編碼基因，例如牙釉蛋白（amelogenin,AMEL）缺失也頻繁被報道AMEL作為單拷貝基因，分別位于X染色體（AMELX）的Xp22.1-Xp22.3和Y染色體（AMELY）的Yp11.2上，AMELX的擴增產(chǎn)物相較于AMELY小6bp，這是AMEL能夠區(qū)分不同性別的分子基礎，因此各類商品化的PCR復合擴增試劑盒均應用AMEL基因座進行性別確定。AMELY在性別確定過程中非常的重要，如果男性AMELY無效擴增，將只能檢測到AMELX，無法檢測到AMELY，會導致男性樣品STR分型結果為女性。一般情況下，AMELY的無效擴增有3種原因：引物結合位點突變、Yp11.2上包含AMELY的缺失或者是Y染色體異常。引物結合位點突變的情況可以通過更換不同引物結合區(qū)域的試劑盒或者設計新的引物組來驗證。如果是Yp11.2區(qū)域缺失，一些接近AMELY的基因座，例如DYS456、DYS458、DYS570和DYS576也有可能出現(xiàn)連鎖缺失，因此可以通過檢測其它的Y-STR進行驗證。如果是Y染色體異常，比如Y染色體q臂缺失或者缺失整條Y染色體，可以通過檢測其它的Y-STR進行驗證。1材料和方法1.1親權鑒定案件,親權鑒定案件,應視角下設計親權鑒定案件，應前后執(zhí)受檢樣本來自濟寧醫(yī)學院司法鑒定中心法醫(yī)物證實驗室受理承辦的親權鑒定案件。PCR復合擴增試劑盒檢測FTA卡上血液樣本發(fā)現(xiàn)AMELY無效擴增并確認AMELY區(qū)域缺失，取被檢父子的新鮮血液后提取DNA并通過PCR檢測STS位點。1.2分析ab公司PCR擴增儀（AB公司，美國）；ABI3500遺傳分析儀（AB公司，美國）；GeneMapperID-X1.4軟件（AB公司，美國）；Goldeneye20APCR擴增試劑盒（基點認知公司，中國）；華夏1.3pcr擴增產(chǎn)物長度及位點位置的確定查閱文獻常用的和UCSC數(shù)據(jù)庫（/）中獲取的SRY和STS位點，在UniSTSdatabase(/pub/ProbeDB/legacy＿unists/UniSTS＿human.sts）中確定相應位點在Y染色體上的位置、擴增所需引物序列和PCR擴增產(chǎn)物長度。對比NCBI(/nuccore/）下載的Y染色體相應區(qū)域的核苷酸序列，篩選適于PCR擴增的STS位點，并針對關鍵位點借助NCBI進行引物設計，詳見表1。1.4吸附柱cb3取20μl新鮮血液，加入20μl蛋白酶K混勻后加入200μl緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃加熱10min。加入200μl無水乙醇，充分顛倒混勻15次，將溶液全部加入吸附柱CB3中12000rpm離心30s，倒掉廢液。用500μl緩沖液GD清洗CB3，離心后棄掉液體。加入600μl漂洗液PW洗CB3兩次，離心后棄掉液體。將CB3中12000rpm離心2min后晾干，加入50μl洗脫液TE，室溫放置2min后12000rpm離心2min，收集溶液。1.5pcr擴增溫度的確定首先應用梯度PCR篩選各引物對合適的退火溫度，溫度梯度設計為55～62℃，各對引物在56～58℃均可良好擴增，因此選定退火溫度為57℃。以兩個樣本的DNA為模板進行PCR擴增。配制濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠，PCR擴增產(chǎn)物在100V的電場作用下置于1×TAE電泳緩沖液中進行電泳約30min，隨后對電泳結果進行分析。2結果2.1ssr分型結果法醫(yī)物證鑒定工作中發(fā)現(xiàn)有一男性AMELY基因無效擴增：該個體生殖器性別為男性，但是Goldeneye20APCR擴增試劑盒STR分型結果顯示只有AMELX峰，華夏2.2y-str分型結果為確證被檢父子的AMELY無效擴增的原因，分別使用Yfilerplus和Goldeneye27YB試劑盒對其進行Y-STR分型：兩樣本均表現(xiàn)為DYS570和DYS576兩個Y-STR基因座擴增失敗，其余Y-STR基因座分型結果正常。2.3sts位點pcr檢測結果為了定位Y染色體上的缺失區(qū)域，通過數(shù)據(jù)庫查找和自行設計引物，對缺失區(qū)域附近的17個STS位點進行檢測，引物序列等信息見表1。檢測結果顯示被檢父子的Yp11.2區(qū)域的STS位點DYS399、SY2220、SY2208、SY2207、DYS463A18、DYS288均能檢測到，而BV703954、BV703904、BV703923、SY2137、SY716、DYS256、DYS267、SY2232、SY2233、DYS261、DYS260等位點均表現(xiàn)為擴增失敗，STS位點擴增結果見表1。3y染色體的缺失被檢父子在AMELY無效擴增的同時，Y-STR中DYS570和DYS576兩個基因座也擴增失敗，而其余Y-STR分型結果正常。這說明被檢父子AMEL無效擴增是由于Y染色體Yp11.2區(qū)域的缺失造成的，同時排除了Y染色體異常。DYS570和DYS576兩個Y-STR基因座位于AMEL基因的3’-端，因此，該結果說明被檢父子兩人的Y染色體缺失了包括AMELY,DYS570和DYS576三個基因座在內(nèi)的片段。在以往的研究中檢測較多的Y染色體的Yp11.2區(qū)域中靠近AMELY的基因座有5個：DYS393,DYS456,DYS458,DYS481和DYS19通過多個STS位點檢測一方面可以排除大范圍內(nèi)多個Y-STR基因座缺失與引物結合序列突變的相關性，還可以進一步明確Yp11.2區(qū)域的缺失范圍。STS位點檢測結果顯示DYS399(4.99Mb）、SY2208(7.73Mb）、SY2207(7.75Mb）、DYS463A18(7.78Mb）、DYS288(7.79Mb）位點均能正常擴增，BV703954(5.08Mb）、BV703904(5.19Mb）、BV703923(5.27Mb）、SY2137(5.41Mb）、SY716(5.56Mb）、DYS256(5.75Mb）、DYS267(6.76Mb）、SY2232(6.79Mb）、SY2233(6.79Mb）、DYS261(7.55Mb）、DYS