山苦保肝活性部位篩選及其化學(xué)成分研究

山苦保肝活性部位篩選及其化學(xué)成分研究

山苦菊i（thumb）nakai是薔薇科的苦水生植物。1材料表面1.1主要設(shè)備本研究所用主要儀器包括JEOL-AL300型核磁共振波譜儀（日本JEOL公司）、R.K.I型CO1.2氨基酚片及試劑山苦荬全草于2017年5月采自?xún)?nèi)蒙古赤峰，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院王素巍講師鑒定為菊科苦荬菜屬植物山苦荬I.chinensis(Thumb)Nakai；標(biāo)本保存于陰涼干燥處。對(duì)乙酰氨基酚片（批號(hào)190811，規(guī)格0.5g）購(gòu)自石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司；SephadexLH-20葡聚糖凝膠（粒徑27～163μm）、DS-401大孔吸附樹(shù)脂（粒徑0.3～1.25mm）均購(gòu)自天津市海光化工有限公司；柱層析硅膠[粒徑分別為100～200目（拌樣）、200～300目（裝柱）]購(gòu)自青島海洋化工有限公司；RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自德國(guó)AppliChem公司；青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、MTT試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；其余試劑均為分析純，水為純化水。1.3細(xì)胞植物人正常肝細(xì)胞株HL-7702購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。2方法和結(jié)果2.1萃取部位的確定采用系統(tǒng)溶劑法提取。取山苦荬全草5kg，剪碎，裝入紗布袋中，用10倍量（L/kg)70%乙醇浸泡提取3次，每次48h。合并提取液，減壓濃縮，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取1次，萃取溶劑與濃縮液的體積比均為2∶1。將各溶劑萃取液溶劑回收后，分別得石油醚萃取部位（52g）、乙酸乙酯萃取部位（27g）、正丁醇萃取部位（133g）以及剩余水部位（209g）。稱(chēng)取上述4種萃取部位適量，用5‰DMSO溶液溶解，然后用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋?zhuān)频米罱K質(zhì)量濃度均為40μg/mL（以生藥量計(jì)）的萃取部位藥液，置于4℃冰箱中保存，以備后續(xù)保肝活性篩選實(shí)驗(yàn)所用。2.2山苦各萃取部位對(duì)現(xiàn)實(shí)細(xì)胞存活率的影響采用MTT法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-7702細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋?zhuān)频妹芏葹?×10采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。山苦荬各萃取部位對(duì)肝細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，與正常組比較，DMSO對(duì)照組細(xì)胞存活率無(wú)顯著變化（P>0.05），提示以5‰DMSO溶液溶解樣品對(duì)細(xì)胞影響不大；與正常組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.01），提示2mg/mL對(duì)乙酰氨基酚可導(dǎo)致人正常肝細(xì)胞損傷；與模型組比較，山苦荬各萃取部位組細(xì)胞的存活率均顯著升高（P<0.01），其存活率大小依次為剩余水部位組>正丁醇萃取部位組>乙酸乙酯萃取部位組>石油醚萃取部位組，提示山苦荬不同萃取部位對(duì)人肝細(xì)胞損傷均有一定的保護(hù)作用。2.3分段測(cè)定草莓寶肝活動(dòng)部位化學(xué)成分2.3.1洗脫和色譜分離參考“2.2”項(xiàng)下結(jié)果，本課題組先針對(duì)活性較高、極性相對(duì)適中的正丁醇萃取部位進(jìn)行化學(xué)成分分離，剩余水部位的化學(xué)成分研究尚在進(jìn)行中（擬后續(xù)另文報(bào)道）。取正丁醇萃取物133g，經(jīng)DS-401大孔吸附樹(shù)脂柱粗分離后，以水-甲醇（100∶0～0∶100,V/V）梯度洗脫，再經(jīng)薄層色譜（TLC）鑒別后，得30%、50%、70%、90%甲醇和水洗脫物。各洗脫部位經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜分離，以不同比例氯仿-甲醇-水進(jìn)行洗脫，再借助SephadexLH-20葡聚糖凝膠柱純化、重結(jié)晶、TLC鑒別等方法，得到8個(gè)化合物。其中，從50%甲醇洗脫物中分離得化合物Ⅰ（18mg）、Ⅱ（20mg）、Ⅶ（15mg）；從70%甲醇洗脫物中分離得化合物Ⅲ（23mg）、Ⅳ（22mg）、Ⅴ（18mg）；從90%甲醇洗脫物中分離得到化合物Ⅵ（14mg）、Ⅷ（6mg)2.3.2化合物鑒定方法根據(jù)理化性質(zhì)和波譜（氫譜、碳譜）數(shù)據(jù)分析鑒定山苦荬正丁醇萃取部位的活性成分（由于化合物Ⅶ、Ⅷ量少，無(wú)法有效鑒定，本文略去）?；衔铫瘢喊咨勰?，分子式為C化合物Ⅱ：黃色針晶，分子式為C化合物Ⅲ：黃色顆粒，分子式為C化合物Ⅳ：黃色粉末，分子式為C化合物Ⅴ：淡黃色針狀結(jié)晶，分子式為C化合物Ⅵ：黃色針晶，分子式為C3山苦保肝活性部位的初步篩選及活性成分的篩選本課題組前期初步研究了山苦荬的體外抗腫瘤活性，考察該藥材不同提取物在不同質(zhì)量濃度（5000、1000、200、40、8μg/mL，均以生藥量計(jì)）下對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的影響。結(jié)果顯示，在較低的質(zhì)量濃度40μg/mL下，山苦荬石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位和剩余水部位對(duì)細(xì)胞的影響均表現(xiàn)出了明顯差異，故本研究以40μg/mL為給藥濃度進(jìn)行山苦荬保肝活性部位的篩選。本研究從山苦荬70%乙醇提取物中依次得到極性由小到大的5個(gè)萃取部位，即石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位和剩余水部位。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，山苦荬保肝活性部位主要集中在正丁醇萃取部位和剩余水部位?；诨瘜W(xué)成分極性特征，本研究以山苦荬正丁醇萃取部位為研究對(duì)象，運(yùn)用硅膠柱層析、SephadexLH-20葡聚糖凝膠柱層析、重結(jié)晶等方法對(duì)其進(jìn)行分離純化，得到8個(gè)單體化合物；借助理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)將其中6個(gè)化合物（Ⅰ～Ⅵ）依次鑒定為苦荬菜木脂素A、木犀草素、木犀草素7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷甲酯、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷甲酯。值得注意的是，本研究在對(duì)山苦荬正丁醇部位進(jìn)行分離純化時(shí)發(fā)現(xiàn)，其大孔吸附樹(shù)脂30%甲醇洗脫部分也具有一定的保肝活性，但未能分離到單體化合物；此外，在后續(xù)的初步活性評(píng)價(jià)中，本課題組發(fā)現(xiàn)1×10綜上所述，本研究對(duì)山苦荬乙醇提取物進(jìn)行了保肝活性部位篩選，并對(duì)活性部位的化學(xué)成分進(jìn)行了鑒定