重組DNA技術(shù)的基本工具 高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第三章

基因工程常見的轉(zhuǎn)基因植物基因工程1.定義：基因工程是指按照人們的愿望，通過(guò)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫作重組DNA技術(shù)。變異類型（原理）：基因重組轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因拼接技術(shù)2.基本過(guò)程：抗蟲棉是如何培育出來(lái)的呢？提取抗蟲基因棉花細(xì)胞

普通棉花

(無(wú)抗蟲特征)(含抗蟲基因)

轉(zhuǎn)基因棉花(有抗蟲特征)培育抗蟲棉的基本過(guò)程

目的基因2.基本過(guò)程：蘇云金桿菌(有抗蟲特征)

受體細(xì)胞賦予生物新的遺傳特性導(dǎo)入表達(dá)科技探索之路第三章

基因工程第1節(jié)

重組DNA技術(shù)的基本工具

番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲。當(dāng)番木瓜被這種病毒感染后，產(chǎn)量會(huì)大大下降。科學(xué)家通過(guò)精心設(shè)計(jì)，用“分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒。DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對(duì)如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，更需要專門的“分子工具”。那么，科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？從社會(huì)中來(lái)轉(zhuǎn)基因番木瓜培育的基本過(guò)程？基本過(guò)程：切割→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)切割目的基因番木瓜細(xì)胞普通番木瓜

轉(zhuǎn)基因番木瓜某生物導(dǎo)入（載體）表達(dá)拼接分子手術(shù)刀分子縫合線分子運(yùn)輸車一、限制性內(nèi)切核酸酶---“分子手術(shù)刀”1.限制酶主要來(lái)源：限制酶2.如何理解“限制性”：主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的旁欄思考：限制酶是一種防御性工具，切割入侵的外源核酸，使之失效，以保證自身安全P74拓展應(yīng)用：識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開作用部位

細(xì)菌本身DNA無(wú)特定的識(shí)別序列

細(xì)菌對(duì)自身特定序列修飾保護(hù)（甲基化）4.限制酶只是一種酶嗎？其識(shí)別序列如何？一、限制性內(nèi)切核酸酶---“分子手術(shù)刀”限制酶是一類酶限制酶有數(shù)千種：識(shí)別序列：3.如何理解“內(nèi)切”：從中間切割DNA序列外切酶：從一端切割DNA序列大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成；少數(shù)限制酶的識(shí)別序列由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量的核苷酸組成。（回文序列）EcoRⅠ：SmaⅠ：5′3′5′3′EcoRⅠ中心軸線5′3′5′3′SamⅠ黏性末端平末端5.切割結(jié)果一、限制性內(nèi)切核酸酶---“分子手術(shù)刀”(AATT)(1)哪種限制酶切割B片段產(chǎn)生的DNA片段能與限制酶SpeⅠ切割的A片段產(chǎn)生的DNA片段相連接，為什么？2.有2個(gè)不同來(lái)源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ進(jìn)行切割，B片段分別用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ進(jìn)行切割，各限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如下：XbaⅠ因?yàn)閄baⅠ與SpeⅠ切割產(chǎn)生了相同的黏性末端拓展應(yīng)用黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端平末端同尾酶二、DNA連接酶——“分子縫合針”2.遵循原則：能夠?qū)蓚€(gè)DNA片段連接起來(lái)的酶1.定義：堿基互補(bǔ)配對(duì)原則3.種類：E.coliDNA連接酶；T4DNA連接酶類型來(lái)源功能相同點(diǎn)差別E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體作用位點(diǎn)：只能連接黏性末端都能連(平末端效率較低)3.種類：二、DNA連接酶---“分子縫合針”旁欄思考：DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？磷酸二酯鍵在DNA復(fù)制時(shí)，將單個(gè)核苷酸連接到DNA片段上，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶：DNA聚合酶：DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？能夠?qū)蓚€(gè)DNA片段連接起來(lái)，形成磷酸二酯鍵。不同點(diǎn)：共同點(diǎn)：DNA聚合酶連接的是單個(gè)脫氧核苷酸，需要模板；不需要模板；DNA連接酶連接的是DNA片段，都是催化磷酸二酯鍵形成的酶三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體---“分子運(yùn)輸車”接受外源基因的細(xì)胞1.常用載體--質(zhì)粒：質(zhì)粒定義：質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。質(zhì)粒的本質(zhì)質(zhì)粒作為載體的優(yōu)勢(shì)：具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)進(jìn)行自我復(fù)制便于重組DNA分子的鑒定和篩選標(biāo)記基因2.載體需要具備的條件：

基因可插入其中：具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)；

復(fù)制的能力：能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存；

帶有特殊的標(biāo)記基因：便于篩選和鑒定；對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害（安全性）；易分離獲得。三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體---“分子運(yùn)輸車”真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的。3.其他載體：噬菌體、動(dòng)植物病毒等思考·討論重組DNA分子：請(qǐng)你根據(jù)圖3-3中的相關(guān)信息找到兩條片段上EcoR

I的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)。然后，用剪刀進(jìn)行“切割”。待切割位點(diǎn)全部切開后，將從下面那條DNA鏈上切下的片段重組到上面那條DNA鏈的切口處，并用透明膠條將切口粘連起來(lái)。1.剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。2.不能，因?yàn)榛虻拈L(zhǎng)度一般在100個(gè)堿基對(duì)以上。DNA的粗提取與鑒定一、實(shí)驗(yàn)原理：1．提取DNA的原理2．鑒定DNA的原理DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA與蛋白質(zhì)。在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法對(duì)它們進(jìn)行提取。DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。（分離提取DNA）（溶解提純DNA）新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。二、材料用具1.選材：DNA的粗提取與鑒定思考：選材能否是：哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞？2.試劑：①研磨液；②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精；③2mol/L的NaCl溶液；④二苯胺試劑DNA含量較高稱取洋蔥，切碎，放入研缽，倒入研磨液，充分研磨。方法一：在漏斗中墊上紗布過(guò)濾研磨液，4℃冰箱中靜置后取上清液；或?qū)⒀心ヒ旱谷胨芰想x心管中離心，取上清液。方法二：直接將研磨液倒入塑料離心管中，1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，取上清液。2.去除雜質(zhì)—1.研磨——目的：將細(xì)胞破裂，釋放DNA三、方法步驟SDS(洗滌劑)：破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性，但不破壞DNADNA的粗提取與鑒定DNA在此在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液,靜置2~3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。3.DNA的析出—方法一：用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物；方法二：將溶液倒入塑料離心管中離心，取沉淀物晾干。析出DNA抑制核酸水解酶的活性，抑制DNA降解；易形成DNA沉淀析出DNA避免破壞DNADNA的粗提取與鑒定4．DNA的鑒定試管編號(hào)AB步驟1步驟2步驟3步驟4實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)結(jié)論2mol/L的NaCl溶液2mol/L的NaCl溶液不進(jìn)行任何處理加絲狀物或沉淀加4mL二苯胺，混勻加4mL二苯胺，混勻沸水浴5min沸水浴5min溶液不變藍(lán)色溶液逐漸變成藍(lán)色實(shí)驗(yàn)組中含有DNADNA充分溶解后，再加入二苯胺顏色的深淺代表:DNA的粗提取與鑒定DNA含量的多少對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組若用X和Y兩種限制酶處理DNA片段，酶切后進(jìn)行電泳分析（酶切圖