動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座

2.2動物細胞工程生產(chǎn)單克隆抗體等

動物細胞工程慣用技術(shù)動物細胞培養(yǎng)動物細胞核移植動物細胞融合是其它動物細胞工程技術(shù)基礎。動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第1頁一.動物細胞培養(yǎng)怎樣進行細胞培養(yǎng)?2.2.1動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)從動物機體中取出相關(guān)組織，將它們分散成單個細胞，然后放在適宜培養(yǎng)基中，讓這些細胞生長和增殖。(一)概念

閱讀P44-P45頁回答下列問題問題1：試說動物細胞培養(yǎng)大致過程、原理動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第2頁(二)動物細胞培養(yǎng)過程胚胎或幼齡動物器官、組織細胞懸液10-50代細胞剪碎胰蛋白酶或膠原蛋白酶胰蛋白酶處理分瓶培養(yǎng)原代培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)不能最終培養(yǎng)成生物體細胞增殖遲緩，核型可能改變貼壁生長接觸抑制10代以內(nèi)，保持正常二倍體核型傳代培養(yǎng)單個細胞培養(yǎng)液原理：有絲分裂動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第3頁問題4：為何用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理？問題2：、為何選取動物胚胎或幼齡個體器官或組織做動物細胞培養(yǎng)材料？因為其細胞生命力旺盛，分裂能力強，分化程度低。問題3、為何培養(yǎng)前要將組織細胞分散成單個細胞？分散成單個細胞、細胞群（團）后輕易培養(yǎng)，細胞所需營養(yǎng)輕易供給，其代謝廢物輕易排出動物組織細胞間隙中含有一定量彈性纖維等蛋白質(zhì)，胰蛋白酶處理動物組織，能夠使動物組織細胞間蛋白質(zhì)和細胞外其它成份酶解，取得單個細胞。

問題5：為何用胰蛋白酶處理而不用胃蛋白酶？動物細胞培養(yǎng)最適PH值為7.2-7.4，胰蛋白酶作用適宜PH為7.2-8.4，胃蛋白酶適宜PH為2.胃蛋白酶在PH為7.2-7.4動物細胞培養(yǎng)中無活性。問題6：用胰蛋白酶處理不會把所培養(yǎng)細胞消化掉嗎？控制好時間！長時間處理當然會損傷細胞。動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第4頁

當原代培養(yǎng)細胞處于接觸抑制后,用胰蛋白酶處理,使細胞從瓶壁上脫離下來,然后加入新培養(yǎng)液,將細胞分離稀釋,并從原培養(yǎng)瓶內(nèi)轉(zhuǎn)接到新培養(yǎng)瓶內(nèi),這個過程稱傳代培養(yǎng).（分瓶培養(yǎng)過程）②傳代培養(yǎng)①原代培養(yǎng)定義：人們通常將動物組織消化后首次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。強調(diào)一：原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第5頁細胞懸浮液10代細胞50代細胞無限傳代原代培養(yǎng)（普通）傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)、細胞株和細胞系（了解）▲細胞株：傳代細胞普通能傳到40-50代，遺傳物質(zhì)普通不會發(fā)生改變，叫細胞株。▲細胞系：傳代50代以后，部分細胞遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，能無限增殖，取得不死性，叫細胞系。動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第6頁強調(diào)二：細胞貼壁過程■細胞貼壁：在培養(yǎng)瓶懸液中分散細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。■培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿壁要求：表面光滑、無毒、易于帖附。動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第7頁■當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時,細胞就會停頓分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞接觸抑制。強調(diào)三：接觸抑制動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第8頁

多細胞動物和人體細胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，依據(jù)你所學內(nèi)環(huán)境知識，思索以下問題：1.體外培養(yǎng)細胞時需要提供哪些物質(zhì)？

2.體外培養(yǎng)細胞需要什么樣環(huán)境條件？

P46討論充分營養(yǎng)（糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素等合成成份及血清、血漿等天然成份。）適宜溫度、PH和氣體環(huán)境；無菌無毒環(huán)境動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第9頁(三)動物細胞培養(yǎng)條件P461、無菌、無毒環(huán)境（無菌處理和添加抗生素目標？更換培養(yǎng)液好處？）2、營養(yǎng):與體內(nèi)相同，液體合成培養(yǎng)基：糖、氨基酸、促生長因子、水、無機鹽、微量元素等，通常需加入血清、血漿等一些天然成份。3、溫度和PH4、氣體環(huán)境95%空氣、5%CO2--維持培養(yǎng)液PH適宜溫度：人和哺乳動物細胞最適溫度為36.5±0.5℃。適宜酸堿度：PH：7.2-7.4動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第10頁動物細胞培養(yǎng)液主要成份是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨特之處？主要成份：（葡萄糖、氨基酸）、（水、無機鹽）、維生素和動物血清等。獨特之處有：1、液體培養(yǎng)基2、成份中有動物血清等動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第11頁P47最上面1、大規(guī)模生產(chǎn)生物制品。2、培養(yǎng)動物細胞作為基因工程受體細胞。3、檢測判斷物質(zhì)毒性。4、培養(yǎng)正?；蚋鞣N病變細胞，用于生理、病理、藥理等方面研究，如用于

等，為

及其它疾病提供理論依據(jù)。(四)動物細胞培養(yǎng)技術(shù)應用篩選抗癌藥品治療和預防癌癥動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第12頁植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)比較比較項目植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原理細胞全能性細胞增殖培養(yǎng)基性質(zhì)固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基特有成份蔗糖植物激素葡萄糖動物血清培養(yǎng)結(jié)果植物體細胞株、細胞系培養(yǎng)目標快速繁殖、培育無病毒植株取得細胞或細胞分泌蛋白動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第13頁我收獲了什么？動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第14頁背誦1、動物細胞培養(yǎng)過程、注意問題2、動物細胞培養(yǎng)條件、注意問題3、動物細胞培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng)比較動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第15頁動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第16頁相互接觸接觸抑制單層胰蛋白酶衰老或死亡不死性降低降低動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第17頁活細胞膜含有選擇透過性，大分子染料不能進入細胞，故不染色。中低溫新陳代謝酶抗原動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第18頁二.動物細胞核移植技術(shù)和克隆動物將動物一個細胞核，移入一個已經(jīng)去掉細胞核卵母細胞中，使其重組并發(fā)育成為一個新胚胎，這個新胚胎最終發(fā)育為動物個體（克隆動物）分類胚胎細胞核移植：體細胞核移植：細胞分化程度低，恢復全能性輕易

細胞分化程度高，恢復全能性不輕易(一)、動物細胞核移植概念：動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第19頁動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第20頁(二)、體細胞核移植過程：請看教材P48圖2-21思索：1.核移植受體細胞是什么？處于什么時期？用此細胞作為受體細胞有什么好處？2.經(jīng)過什么伎倆激活受體細胞，構(gòu)建重組胚胎？MⅡ中期卵母細胞誘導方法：物理或化學方法激活受體細胞，完成細胞分裂和發(fā)育進程。卵母細胞體積大，便于操作；含有營養(yǎng)物質(zhì)豐富，提供早期胚胎發(fā)育所需營養(yǎng)；含有激活細胞核表達全能性物質(zhì)。動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第21頁(二)、體細胞核移植過程：動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第22頁P49討論：1.在體細胞細胞核移植到受體卵母細胞之前，為何必須先去掉受體卵母細胞核？為使核移植胚胎或動物遺傳物質(zhì)全部來自有主要利用價值動物提供體細胞，在供體細胞細胞核移至受體細胞之前，必須將受體細胞遺傳物質(zhì)去掉或?qū)⑵淦茐?P49小資料）。動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第23頁培養(yǎng)動物細胞普通當傳代至10～50代左右時，部分細胞核型可能會發(fā)生改變，其細胞遺傳物質(zhì)可能會發(fā)生突變，而10代以內(nèi)細胞普通能保持正常二倍體核型。所以，在體細胞核移植中，為了確保供體細胞正常遺傳基礎，通常采取傳代10代以內(nèi)細胞。2.用于核移植供體細胞普通都選取傳代10代以內(nèi)細胞，想一想，這是為何？動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第24頁3.你認為用上述體細胞核移植方法生產(chǎn)克隆動物，是對體細胞供體動物進行了100%復制嗎？為何？絕大部分DNA來自于供體細胞核，但其核外還有少許DNA，即線粒體中DNA是來自于受體卵母細胞。另外，即便動物遺傳基礎完全相同，但動物一些行為、習性形成與所處環(huán)境有很大關(guān)系，核供體動物生活環(huán)境與克隆動物所生活環(huán)境不會完全相同，其形成行為、習性也不可能和核供體動物完全相同，從這一角度看，克隆動物不會是核供體動物100%復制。動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第25頁(三)、體細胞核移植技術(shù)應用前景：1、在畜牧業(yè)中能夠加速家畜遺傳改良進程2、保護瀕危物種3、醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)及組織器官移植4、了解胚胎發(fā)育和衰老過程；追蹤研究疾病發(fā)展過程和治療疾病動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第26頁閱讀書本P50頁(四)、體細胞核移植技術(shù)存在問題：動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第27頁思索與探究1.幼齡與老齡動物組織細胞比較，分化程度低與分化程度高組織細胞比較，哪一個更易于培養(yǎng)？思索一下，這是什么道理？

提醒：細胞衰老與動物機體衰老有著親密關(guān)系，細胞增殖能力與供體年紀相關(guān)，幼齡動物細胞增殖能力強，有絲分裂旺盛，老齡動物則相反。所以，普通來說幼年動物組織細胞比老年動物組織細胞易于培養(yǎng)。一樣，組織細胞分化程度越低，則增殖能力越強，所以更輕易培養(yǎng)。動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第28頁思索與探究2.動物細胞培養(yǎng)要經(jīng)過脫分化過程嗎？為何？動物細胞培養(yǎng)不需經(jīng)過脫分化過程。因高度分化動物細胞發(fā)育潛能變窄，失去了發(fā)育成完整個體能力，所以，動物細胞也就沒有類似植物組織或細胞培養(yǎng)時脫分化過程了。要想使培養(yǎng)動物細胞定向分化，通常采取定向誘導動物干細胞，使其分化成所需要組織或器官。動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第29頁3.1997年，美國威斯康星州一個奶牛場有一頭名叫盧辛達（Lucinda）奶牛，年產(chǎn)奶量為30.8t，創(chuàng)造了世界奶牛產(chǎn)奶量最高新紀錄。目前世界各國高產(chǎn)奶牛場奶牛，年平均產(chǎn)奶量普通為十幾噸，而我國奶牛產(chǎn)奶量年平均水平僅為3～4t。（1）能利用體細胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達嗎？請說明理由。能夠。盧辛達產(chǎn)奶量很高，有高產(chǎn)奶遺傳基礎，利用盧辛達體細胞克隆奶牛其遺傳物質(zhì)基本上全部來自該奶牛，其克隆牛含有高產(chǎn)遺傳基礎，假如精心培育和喂養(yǎng)，有可能在世界范圍內(nèi)推廣，克隆牛再與高產(chǎn)公牛自然繁殖，可得到很多高產(chǎn)后代，從而加緊奶牛改良進程。該克隆牛不能無限制地推廣，其數(shù)量不宜過多，尤其是在小范圍內(nèi)不能無限繁殖，以防止奶牛群出現(xiàn)近親繁殖而引發(fā)種質(zhì)衰退。動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)專業(yè)知識專家講座第30頁（2）假如將克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達任務交給你，你將怎樣對它進行克隆