浙科版一輪公開課復(fù)習(xí)動(dòng)物的克隆公開課一等獎(jiǎng)?wù)n件省賽課獲獎(jiǎng)?wù)n件

動(dòng)物克隆第1頁(yè)動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)克隆培養(yǎng)法單克隆抗體細(xì)胞核移植動(dòng)物克隆常用技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物克隆技術(shù)基礎(chǔ)是動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)細(xì)胞工程主要伎倆是細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞融合第2頁(yè)資料：培養(yǎng)細(xì)胞生存環(huán)境

1.無(wú)菌、無(wú)毒環(huán)境：添加一定量抗生素，定期更換培養(yǎng)液2.合適溫度和PH：35-37℃;PH:7.2-7.43.氣體環(huán)境（CO2培養(yǎng)箱）4.特殊培養(yǎng)液：主要有：葡萄糖、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素和動(dòng)物血清等調(diào)整PH，模擬人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體內(nèi)最適環(huán)境思考：較植物組培培養(yǎng)基有何獨(dú)特之處？1.液體培養(yǎng)基；2.葡萄糖.3、動(dòng)物血清含激素，確保細(xì)胞順利生長(zhǎng)增殖第3頁(yè)細(xì)胞全能性細(xì)胞株、細(xì)胞系植物體培養(yǎng)成果取得細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物培育新植株等培養(yǎng)目葡萄糖、動(dòng)物血清蔗糖、植物激素培養(yǎng)基特有成份液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基性質(zhì)細(xì)胞增殖原理動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項(xiàng)目植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)比較第4頁(yè)一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)首先，將動(dòng)物體內(nèi)一部分組織取出，通過(guò)機(jī)械消化或胰酶消化，使其分散成單個(gè)細(xì)胞；然后，在人工控制培養(yǎng)條件下，使這些細(xì)胞得以生存，并保持生長(zhǎng)、分裂乃致接觸抑制和有規(guī)律衰老、死亡性能等生命活動(dòng)現(xiàn)象。注意：細(xì)胞之間在生命活動(dòng)中互相依存，因此也像體內(nèi)同樣展現(xiàn)一定組織特性。第5頁(yè)細(xì)胞貼壁細(xì)胞貼壁：細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，懸液中分散細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁。要求：培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)表面光滑、無(wú)毒、易于貼附。在培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)構(gòu)造和功能變化第6頁(yè)細(xì)胞在貼壁生長(zhǎng)過(guò)程中,伴隨細(xì)胞分裂,數(shù)量不停增加,最后形成一種單層,此時(shí)細(xì)胞間互相接觸,細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)停頓。接觸抑制第7頁(yè)第8頁(yè)成纖維細(xì)胞型：第9頁(yè)思考幾個(gè)問(wèn)題1、在大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)中都不直接使用人皮膚作為材料而是選用動(dòng)物胚胎或幼齡個(gè)體器官或組織,為何？2、為何培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞？3、胰蛋白酶作用？胃蛋白酶能夠嗎？4、為何要分裝？5、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最后培養(yǎng)成新個(gè)體？培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)因細(xì)胞密度過(guò)大和代謝消耗引發(fā)營(yíng)養(yǎng)枯竭，不能正常生長(zhǎng)。不能，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)只能使細(xì)胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新動(dòng)物個(gè)體由于這些組織或器官上細(xì)胞生命力旺盛，分裂能力強(qiáng)成塊組織不利培養(yǎng)，分散了做成細(xì)胞懸浮液利于培養(yǎng)第10頁(yè)有關(guān)概念原代培養(yǎng)：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)細(xì)胞為原代細(xì)胞。一般是指從開始到傳至10代細(xì)胞培養(yǎng)傳代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞提成若干份，接種到其他培養(yǎng)基中，使其繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖。傳代培養(yǎng)一般指10-50代細(xì)胞培養(yǎng)第11頁(yè)細(xì)胞原代培養(yǎng)

將動(dòng)物機(jī)體多種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)多種酶（常用胰蛋白酶）或機(jī)械辦法處理，分散成單細(xì)胞，置合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖，這一過(guò)程稱原代培養(yǎng)。

第12頁(yè)胰酶消化法1、取材：用手術(shù)剪將組織剪成小塊（1mm2），再洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。4、視組織塊量加入胰酶液，37℃中消化20—40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次.5、加入2ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）,用吸管吹打，沖散細(xì)胞。6、靜置，使未分散組織塊下沉。7、吸取上層細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到兩個(gè)培養(yǎng)皿中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)液，37℃下培養(yǎng)。第13頁(yè)（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期在培養(yǎng)中連續(xù)增殖和生長(zhǎng)時(shí)間。

第14頁(yè)1．原代培養(yǎng)期：從體內(nèi)取出組織,接種培養(yǎng)到第一次傳代階段（初代培養(yǎng)）特點(diǎn)：細(xì)胞呈活躍移動(dòng)、可見細(xì)胞分裂、形態(tài)構(gòu)造和功能活動(dòng)上與體內(nèi)原組織相同性、多呈二倍體核型細(xì)胞群是異質(zhì)，細(xì)胞克隆形成率很低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。第15頁(yè)2．傳代期：初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系。在全生命期中此期連續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸遲緩，以至完全停頓，細(xì)胞進(jìn)入第三期。第16頁(yè)3．衰退期：此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)，由于某種原因影響，細(xì)胞也許發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化標(biāo)志之一是細(xì)胞也許取得永生性或惡性。第17頁(yè)細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣細(xì)胞群體稱無(wú)限細(xì)胞系，也稱連續(xù)細(xì)胞系。無(wú)限細(xì)胞系形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工辦法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞也也許具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。第18頁(yè)細(xì)胞懸液10代細(xì)胞50代細(xì)胞無(wú)限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)總結(jié)多呈二倍體核型細(xì)胞群是異質(zhì)傳代后稱做細(xì)胞系轉(zhuǎn)化細(xì)胞也許取得永生性或惡性—異體致瘤永生性也稱不死性，又稱無(wú)限細(xì)胞系，也稱連續(xù)細(xì)胞系，大多變成異倍體有限細(xì)胞系（二倍體）第19頁(yè)細(xì)胞系、細(xì)胞株細(xì)胞株：通過(guò)一定選擇或純化辦法，從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中取得具有特殊性質(zhì)細(xì)胞，稱為細(xì)胞株。特點(diǎn)：一般具有恒定染色體組型、同功酶類型、病毒敏感性和生化特性等。連續(xù)細(xì)胞株：能夠連續(xù)數(shù)次傳代有限細(xì)胞株：可傳代次數(shù)有限細(xì)胞系：異質(zhì)性細(xì)胞株：純系第20頁(yè)★如何取得純系細(xì)胞系？把一種細(xì)胞從群體中分離出來(lái)單獨(dú)培養(yǎng)（克隆培養(yǎng)法）第21頁(yè)二、克隆培養(yǎng)法1、克隆培養(yǎng)法概念：把一種細(xì)胞從群體中分離出來(lái)培養(yǎng)，使之繁殖成一種新細(xì)胞群體技術(shù)。（克隆培養(yǎng)與群體培養(yǎng)是一種等位概念）2、特性：純系（遺傳性狀均一、體現(xiàn)性狀相同）3、基本要求：必須確保分離出來(lái)細(xì)胞是一種而不是多種。4、克隆難易程度:單細(xì)胞不如群體細(xì)胞原代細(xì)胞、有限細(xì)胞系＜連續(xù)細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化或腫瘤細(xì)胞5、提升克隆形成率措施：選擇合適培養(yǎng)基、添加血清（胎牛血清）、滋養(yǎng)細(xì)胞（如經(jīng)射線照射本身是去增值力小鼠成纖維細(xì)胞）、激素（胰島素等）刺激、CO2培養(yǎng)箱、調(diào)整PH值等6、用途：如從一般細(xì)胞系中分離出缺乏特殊基因突變細(xì)胞系。第22頁(yè)三、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)及其應(yīng)用★

什么是細(xì)胞融合技術(shù)？★

為何要進(jìn)行細(xì)胞融合？★

如何實(shí)現(xiàn)細(xì)胞融合？第23頁(yè)

定義

指用自然或人工辦法,使兩個(gè)或多種不一樣細(xì)胞融合成一種細(xì)胞過(guò)程。

不一樣基因型細(xì)胞之間融合就是細(xì)胞雜交。1、動(dòng)物細(xì)胞融合受精作用兩個(gè)細(xì)胞正在融合第24頁(yè)

誘導(dǎo)融合原因生物法：滅活仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)融合利用滅活仙臺(tái)病毒是動(dòng)物細(xì)胞融合所特有。這是由于病毒磷脂外衣與動(dòng)物細(xì)胞膜十分相同緣故。病毒外殼上某些糖蛋白也許尚有促進(jìn)細(xì)胞融合功能?；瘜W(xué)法：聚乙二醇誘導(dǎo)融合由于聚乙二醇易得、簡(jiǎn)便，且融合效果穩(wěn)定，是目前應(yīng)用最廣泛辦法。物理法：電刺激誘導(dǎo)融合病毒顆粒黏附細(xì)胞表面細(xì)胞膜連接細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞融合、形成雜種細(xì)胞第25頁(yè)5、應(yīng)用1.由于細(xì)胞雜交中染色體容易丟失，因此利用雜交細(xì)胞檢測(cè)特定染色體丟失與特定基因產(chǎn)物減少對(duì)應(yīng)關(guān)系，能夠進(jìn)行基因定位。3.利用雜交瘤技術(shù)，制備單克隆抗體。2.克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙鼠—雞、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—雞、人—蛙、酵母菌—雞、人—胡蘿卜等此技術(shù)有什么缺陷和長(zhǎng)處？第26頁(yè)小鼠單克隆抗體制備第27頁(yè)雜交瘤制備融合前準(zhǔn)備工作細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞篩選單克隆抗體大量制備第28頁(yè)主要設(shè)備

凈化工作臺(tái)

超凈工作臺(tái)是一種無(wú)菌操作裝置，其原理是內(nèi)設(shè)鼓風(fēng)機(jī)，驅(qū)動(dòng)空氣通過(guò)高效濾器凈化后，讓凈化后空氣漸漸通過(guò)臺(tái)面空間，使工作場(chǎng)地組成無(wú)菌環(huán)境。組織培養(yǎng)材料準(zhǔn)備第29頁(yè)主要設(shè)備

CO2恒溫培養(yǎng)箱

骨髓瘤和雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)都需要在恒定溫度條件下才能生存，溫度變化一般不應(yīng)超出0.5度。因此要求培養(yǎng)箱應(yīng)具有較高敏捷度；電熱恒溫箱質(zhì)量關(guān)鍵在于控溫裝置優(yōu)劣。CO2恒溫培養(yǎng)箱已成為普遍應(yīng)用設(shè)備，長(zhǎng)處是箱內(nèi)能恒定地提供一定量二氧化碳，一般用5%，可使培養(yǎng)液維持穩(wěn)定pH，減少調(diào)pH麻煩。組織培養(yǎng)材料準(zhǔn)備第30頁(yè)主要設(shè)備

離心機(jī)培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)常需要制備細(xì)胞懸液、漂洗，需離心分離細(xì)胞，要求每分1000轉(zhuǎn)左右，故一般小型臺(tái)式離心機(jī)即符合要求。組織培養(yǎng)材料準(zhǔn)備第31頁(yè)主要設(shè)備

培養(yǎng)液過(guò)濾裝置

多種培養(yǎng)用液只能用過(guò)濾辦法進(jìn)行除菌做消毒處理?，F(xiàn)多用微孔濾膜，密度有不一樣型號(hào)，尺寸有不一樣規(guī)格。組織培養(yǎng)材料準(zhǔn)備第32頁(yè)主要設(shè)備

多孔培養(yǎng)板、塑料器皿

組織培養(yǎng)材料準(zhǔn)備第33頁(yè)骨髓瘤細(xì)胞懸液制備骨髓瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)50ml離心管1000r/min離心5-10min離心洗滌骨髓瘤細(xì)胞懸液活細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用融合前48-36h融合當(dāng)天30ml不完全培養(yǎng)基10ml不完全培養(yǎng)基0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液

第34頁(yè)脾細(xì)胞懸液制備小鼠脾臟直徑10cm平皿剝離周圍結(jié)締組織

剪刀剪碎、注射器芯擠壓?jiǎn)渭?xì)胞懸液直徑10cm平皿10ml不完全培養(yǎng)基

銅網(wǎng)過(guò)濾

10ml不完全培養(yǎng)基

輕輕洗滌

第35頁(yè)脾細(xì)胞懸液制備脾細(xì)胞懸液1000r/min離心5-10min離心洗滌1-2次脾細(xì)胞懸液活細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用50ml不完全培養(yǎng)基10ml不完全培養(yǎng)基0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液

第36頁(yè)1234mmmm12341234單克隆抗體細(xì)胞融合取出脾細(xì)胞+癌細(xì)胞各抗體分開傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234B細(xì)胞抗原免疫小鼠后，其脾臟會(huì)產(chǎn)生分泌抗體多種B細(xì)胞。每種B細(xì)胞只能分泌一種抗體，反抗各自抗原決定基。傳統(tǒng)抗血清便是所有抗體混合，得以有效保護(hù)動(dòng)物個(gè)體。假如能夠把單一種B細(xì)胞挑出來(lái)培養(yǎng)，則可收獲單一種抗體。不過(guò)，B細(xì)胞無(wú)法在試管中培養(yǎng)生長(zhǎng)。癌細(xì)胞可以在試管中連續(xù)培養(yǎng)生長(zhǎng)，但無(wú)法產(chǎn)生所要抗體。這些單獨(dú)融合細(xì)胞能夠大量生產(chǎn)單獨(dú)一種抗體，就是單克隆抗體。若把B細(xì)胞與癌細(xì)胞融合，所得到融合細(xì)胞則可分別培養(yǎng)。第37頁(yè)骨髓瘤細(xì)胞致敏B淋巴細(xì)胞雜交瘤第38頁(yè)骨髓瘤細(xì)胞脾細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞融合后細(xì)胞類型:

雜交瘤技術(shù)理論基礎(chǔ)融合細(xì)胞篩選技術(shù)第39頁(yè)融合細(xì)胞篩選技術(shù)生化代謝缺陷型骨髓瘤細(xì)胞系單克隆抗體產(chǎn)生原理HAT培養(yǎng)基根據(jù)篩選雜交瘤細(xì)胞特殊培養(yǎng)液。

第40頁(yè)融合后細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況不能長(zhǎng)期生長(zhǎng)死亡生化代謝正常能夠長(zhǎng)期生長(zhǎng)生長(zhǎng)繁殖死亡生化代謝缺陷能夠長(zhǎng)期生長(zhǎng)生化代謝正常第41頁(yè)雜交瘤細(xì)胞篩選

脾細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合HAT初步篩選篩選陽(yáng)性克隆單克隆抗體產(chǎn)生原理第42頁(yè)操作步驟篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆每孔加待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，同步設(shè)置陽(yáng)性（免疫鼠血清）、陰性對(duì)照（完全培養(yǎng)基）和空白對(duì)照。第43頁(yè)單克隆抗體大量制備動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)法體外培養(yǎng)法小鼠腹水誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)液第44頁(yè)制備雜交瘤培養(yǎng)上清

雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)增1:10百分比轉(zhuǎn)入新瓶離心、搜集上清檢測(cè)抗體滴度分裝、無(wú)菌保存

37℃5％CO2

5d

第45頁(yè)制備單克隆抗體腹水

動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)單抗是最實(shí)用大量制備單抗辦法。使用動(dòng)物首選BALB/c小鼠。原理：將雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠腹腔內(nèi)，在小鼠腹腔內(nèi)生長(zhǎng)雜交瘤，并產(chǎn)生腹水，因而可得到大量腹水單抗且抗體濃度很高。注射細(xì)胞前一般先用降植烷或液體石蠟處理腹腔，方便產(chǎn)生大量腹水。缺陷：腹水中常混有小鼠多種雜蛋白（包括Ig）；有污染動(dòng)物病毒危險(xiǎn)。第46頁(yè)制備單克隆抗體腹水

腹腔接種降植烷或液體石蠟（0.5-1ml/只）

7-10天腹腔接種無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋雜交瘤細(xì)胞，5×105/只

第47頁(yè)制備單克隆抗體腹水

7-10天采集腹水2023r/min，5min搜集上清，測(cè)定抗體效價(jià)分裝，凍存?zhèn)溆?/p>

第48頁(yè)第49頁(yè)思考：（1）為何用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合？

細(xì)胞同源性越近，融合形成雜種細(xì)胞越易成活。繼承了雙親細(xì)胞遺傳物質(zhì)，不但具有B細(xì)胞分泌抗體能力，并且尚有沒有限增殖本事，因而能夠取得大量單克隆抗體。（2）骨髓瘤細(xì)胞是癌細(xì)胞嗎？有沒有限增殖能力細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，而具有轉(zhuǎn)移能力腫瘤細(xì)胞，稱為癌細(xì)胞，因此瘤細(xì)胞不能等同于癌細(xì)胞。（3）制備過(guò)程為何要通過(guò)兩次篩選？

第一次篩選取得多種雜交瘤細(xì)胞第二次篩選出特異抗體雜交瘤細(xì)胞。(5)本過(guò)程利用了哪些原理？免疫原理、細(xì)胞融合原理、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)原理（4）制備過(guò)程中應(yīng)用哪些細(xì)胞工程技術(shù)伎倆？

細(xì)胞融合技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。第50頁(yè)動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有雜交瘤細(xì)胞才能活動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)取得產(chǎn)生對(duì)應(yīng)抗體B淋巴細(xì)胞取得能產(chǎn)生所需抗體雜交瘤細(xì)胞取得雜交瘤細(xì)胞第51頁(yè)1975年，米爾斯坦（英）和科勒（德）融合選擇性培養(yǎng)基抗體檢測(cè)問(wèn)題探究1.第一次篩選和第二次篩選目標(biāo)有何不一樣？2.單克隆抗體有何特點(diǎn)？單克隆抗體長(zhǎng)處：化學(xué)性質(zhì)單一，特異性強(qiáng)，敏捷度高。第一次篩選：用選擇性培養(yǎng)基取得雜交瘤細(xì)胞。第二次篩選：通過(guò)抗體檢測(cè)取得能產(chǎn)生所需抗體雜交瘤細(xì)胞。第52頁(yè)四、動(dòng)物克隆繁殖★理論上，分化動(dòng)物細(xì)胞能像植物細(xì)胞同樣脫分化、再分化成一種動(dòng)物體嗎？★動(dòng)物細(xì)胞事實(shí)上體現(xiàn)出全能性情況如何呢？第53頁(yè)受精卵>胚胎干細(xì)胞>多能干細(xì)胞>單能干細(xì)胞>體細(xì)胞四、動(dòng)物克隆繁殖（一）動(dòng)物細(xì)胞全能性體現(xiàn)程度如多能造血干細(xì)胞：可分化為紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等（2）低等動(dòng)物細(xì)胞：全能性一般容易體現(xiàn)。如水螅上皮細(xì)胞，不通過(guò)度裂就能夠轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀?、肌肉?xì)胞。（1）高等動(dòng)物細(xì)胞第54頁(yè)（二）動(dòng)物難以克隆主線原因

在動(dòng)物個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，分化成果使得細(xì)胞在形態(tài)和功能上高度特化，這是由于細(xì)胞在伴伴隨它們發(fā)育過(guò)程中在時(shí)間、空間變化，基因體現(xiàn)調(diào)控使得細(xì)胞中合成了專一蛋白質(zhì)。動(dòng)物基因組中，一類基因是維持生存，在多種細(xì)胞中都處于活動(dòng)狀態(tài)。另一類基因伴隨組織器官和發(fā)育階段不一樣而選擇性體現(xiàn)。分化細(xì)胞內(nèi)基因活動(dòng)很不完全，因此很難像受精卵那樣發(fā)揮細(xì)胞全能性。第55頁(yè)胚胎細(xì)胞核移植成功率遠(yuǎn)高于成體細(xì)胞(三)細(xì)胞核移植試驗(yàn)和動(dòng)物克隆繁殖1、過(guò)程：利用一種細(xì)胞細(xì)胞和來(lái)取代另一細(xì)胞中細(xì)胞核，形成一種重建“合子”胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植第56頁(yè)綿羊“多莉”克隆過(guò)程：第57頁(yè)詳細(xì)操作取6歲母綿羊（芬蘭多塞特白品種綿羊）乳腺細(xì)胞作核供體細(xì)胞，用“饑餓法”使其進(jìn)入休眠狀態(tài)而使所有基因具有活性。注射促性腺激素GN促使母羊（蘇格蘭黑面母綿羊）排卵，28－33小時(shí)取其未受精卵迅速去核，放入10%FCS（小牛血清）、1%FCS和0.5%FCS連續(xù)5天，饑餓使進(jìn)入G0期做受體細(xì)胞。

第58頁(yè)在乳腺細(xì)胞與無(wú)核卵放入同一培養(yǎng)皿中，在微電流作用下，將乳腺細(xì)胞核融入卵中，形成一種具有新遺傳物質(zhì)卵細(xì)胞。將新卵細(xì)胞發(fā)育成桑椹期胚胎或囊胚，再移入假孕母羊子宮內(nèi)。產(chǎn)下多莉即為6歲母羊復(fù)制品，也為白色。第59頁(yè)①供體和受體準(zhǔn)備核移植成功主要前提：盡可能確保核供體和受體細(xì)胞處于同樣細(xì)胞周期（同步狀態(tài)）

如何使處于細(xì)胞周期不一樣階段上核供體和受體處于同步狀態(tài)？第60頁(yè)饑餓技術(shù)即在供體細(xì)胞培養(yǎng)基中減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（血清）濃度，使供體細(xì)胞處于“饑餓狀態(tài)”，停頓分裂增殖而休眠。休眠細(xì)胞核進(jìn)入去核卵細(xì)胞后，在卵細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)作用下重新啟動(dòng)分裂程序。這樣，供體細(xì)胞核與受體細(xì)胞質(zhì)才能在分裂相上互相協(xié)調(diào)，配合細(xì)胞才能分裂發(fā)育。第61頁(yè)②去卵膜和卵核如何給受體細(xì)胞去核？◆顯微操作

◆紫外照射◆細(xì)胞松弛素結(jié)合高速離心

第62頁(yè)第63頁(yè)③供體細(xì)胞制備如何獲取供體細(xì)胞核？◆

顯微操作

◆細(xì)胞松弛素結(jié)合高速離心核體胞質(zhì)體第64頁(yè)二、克隆技術(shù)辦法將受體卵細(xì)胞

去核向去核卵細(xì)胞植入供體細(xì)胞移植后細(xì)胞激活后能夠象受精卵同樣發(fā)育形成動(dòng)物個(gè)體，并具有與核供體細(xì)胞相同基因④移核第65頁(yè)⑤移植后重組細(xì)胞激活、培養(yǎng)、胚胎移植◆激活（P52）（使卵母細(xì)胞從MII期解放，轉(zhuǎn)到“受精”狀態(tài)）◆重組胚體內(nèi)或體外培養(yǎng)◆胚胎移植

第66頁(yè)重構(gòu)卵激活正常情況下,受精過(guò)程中，精子進(jìn)入卵子后,卵母細(xì)胞質(zhì)中會(huì)出現(xiàn)一系列反應(yīng),如母源性mRNA啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄等。這些反應(yīng)是卵母細(xì)胞被激活標(biāo)志，不通過(guò)這些變化,胚胎就不能正常發(fā)育。核移植過(guò)程中激活就是模仿受精過(guò)程中精子刺激作用。目前，激活方式主要有：電激活和化學(xué)激活第67頁(yè)顯微操作法進(jìn)行細(xì)胞核移植第68頁(yè)克隆羊成功分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)理：

供體核DNA中有起源于乳腺細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)調(diào)整蛋白，它制止了核基因體現(xiàn)。重組卵細(xì)胞，基因轉(zhuǎn)錄沒開始，無(wú)調(diào)整蛋白重組移核細(xì)胞丟失了源于乳腺細(xì)胞調(diào)整蛋白。通過(guò)三次分裂后，原乳腺細(xì)胞調(diào)整蛋白便所有被卵細(xì)胞質(zhì)中蛋白因子替代了，因此核DNA被重新編排，細(xì)胞開始體現(xiàn)自己基因。第69頁(yè)體細(xì)胞克隆成功意義：1、證明了高度分化細(xì)胞也能夠回復(fù)到類似受

精卵時(shí)期功能。2、證明了細(xì)胞質(zhì)具有調(diào)控細(xì)胞核發(fā)育作用。應(yīng)用：

為遺傳疾病治療、優(yōu)良品種培育等提供了主要途徑；對(duì)瀕危動(dòng)物保存也有主要意義。克隆成功條件（必備基礎(chǔ)）P201、具有包括物種完整基因組細(xì)胞核活細(xì)胞。(如乳腺上皮細(xì)胞)2、能有效調(diào)控細(xì)胞核發(fā)育細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)。（如去核卵細(xì)胞