泰格列凈ames試驗研究

泰格列凈ames試驗研究

pmes試驗是國際上廣泛進行的遺傳毒性試驗之一。泰格列凈是2型鈉離子依賴型葡萄糖協同轉運蛋白(SGLT2)抑制劑類降糖藥物,通過抑制表達于腎臟的SGLT2,減少腎臟的葡萄糖重吸收,增加尿液中葡萄糖的排泄,從而降低血漿葡萄糖水平。本文采用Ames試驗研究泰格列凈有無致突變性。1材料表面1.1菌種收集中心鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100、TA102,引自天津市疾病預防控制中心;TA1535,引自美國模式菌種收集中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC),均于-80℃超低溫冰箱保存。試驗前對各菌株進行了組氨酸缺陷鑒定(his-)、脂多糖屏障缺陷鑒定(rfa)、紫外線修復缺陷鑒定(uvrB)、氨芐青霉素抗性鑒定(pKM101)、四環(huán)素抗性鑒定(PAQ1)、自發(fā)回變數鑒定以及對陽性突變劑的敏感性鑒定,經鑒定各菌株均符合相關要求。1.2試劑和培養(yǎng)基泰格列凈,性狀:白色結晶性粉末,質量分數:99.88%,批號:140211,理化性質:易吸潮,保存條件:常溫、干燥,由天津藥物研究院藥物創(chuàng)新研究中心提供。溶媒對照:二甲基亞砜(DMSO),批號302A039,購自Solarbio。陽性誘變劑:疊氮鈉,批號4660C303,購自Amresco公司;敵克松,由南開大學元素所饋贈;2-氨基蒽,購自TCI公司。瓊脂粉、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,購自北京三藥科技開發(fā)公司;組氨酸,購自天津市光復精細化工研究所;生物素、磷酸氫鈉胺和6-磷酸葡萄糖,購自Sigma-Aldrich公司;氧化性輔酶II(β-nicotinamideadeninedinucleotidephosphate,NADP)。1.3代謝激活系統大鼠肝微粒體酶S9,本實驗室自制,采用苯巴比妥和β-萘黃酮聯合誘導,無菌檢測和代謝活化特性檢測符合實驗要求。1.4儀器和試驗箱恒溫培養(yǎng)箱和高壓蒸汽滅菌器,購自SANYO公司;全溫度振蕩培養(yǎng)箱,購自太倉市華美生化器材廠;恒溫水浴箱,購自天津泰斯特儀器有限公司;電子天平,購自Sartorius公司;超凈工作臺,購自天津市拉貝爾實驗室設備有限公司;顯微鏡,購自日本Nikon公司。2方法2.1泰格列凈劑量選用組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535,泰格列凈劑量設置為5000.000、2500.000、1250.000、625.000、312.500、156.250和78.125μg/皿,另設空白對照組。采用平皿摻入法根據“將不出現明顯的抑菌情況,且產生的沉淀不干擾計數的濃度設定為最高濃度”的原則2.2特芬妮-ames測試應用組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535,采用平皿摻入法2.3e0afs的表達結果應闡明藥物細菌毒性大小和沉淀情況,每皿的回復突變菌落數以ue0af±s表示。當至少在一個菌株上,在有或無代謝活化的情況下,受試物所誘發(fā)的回復突變菌落數出現濃度依賴性的增加和/或在一個或多個濃度組出現可重復性的增加,可判定為陽性結果,反之為陰性3加s9活化條件下回復突變試驗在不加S9活化條件下,計數菌落時未發(fā)現受試物沉淀,結果顯示,泰格列凈劑量為2000、1000μg/皿時,對TA97、TA98、TA100、TA102均有不同程度的抑菌作用,回變菌落數明顯降低,對TA1535無抑菌作用,回變菌落數正常;泰格列凈劑量為500、125μg/皿時,對TA102有一定抑菌作用,回變菌落數降低,對TA97、TA98、TA100和TA1535無抑菌作用,回變菌落數正常;泰格列凈劑量為31.25μg/皿時,對TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535均無抑菌作用,回變菌落數正常;陽性對照組回變菌落數與溶媒對照組比較明顯增加。見表2。在加S9活化條件下,計數菌落時未發(fā)現受試物沉淀,結果顯示,泰格列凈劑量在2000μg/皿時,對TA97、TA98、TA100、TA102均有不同程度的抑菌作用,回變菌落數明顯降低,對TA1535無抑菌作用,回變菌落數正常;泰格列凈劑量在1000μg/皿時,對TA98和TA102有抑菌作用,回變菌落數降低,對TA97、TA100和TA1535無抑菌作用,回變菌落數正常;泰格列凈劑量在31.25、125和500μg/皿時,對TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535均無抑菌作用,回變菌落數正常;陽性對照組回變菌落數與溶媒對照組比較明顯增加。見表3。4受試物回復突變試驗結果Ames試驗是一種快速檢測受試物致突變性和致癌性的方法,而受試物的毒性作用可以導致Ames試驗出現假陽性結果,由于受試物殺死了大部分細菌,使殘存的細菌得以利用培養(yǎng)基中微量的組氨酸和生物素生長成肉眼可見的菌落,結合顯微鏡分析可排除由于受試物毒性導致的假陽性結果,從而提高結果判斷的準確性本研究設置的陽性對照組在有或無S9活化條件下,各菌株回變菌落平均數均超過溶媒對照組回變菌落平均數的2倍,證實試驗系統有效。研究結果顯示,在有或無S9活化系統的情況下,隨著受試物劑量的增加,受試物各劑量組的回變菌落數均未超過溶媒對照組回變菌落數的2倍,且無劑量相關性。結果表明,在有無代謝活化系統條件下,泰格列凈對組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌