脊髓損傷修復(fù)的研究進(jìn)展

脊髓損傷修復(fù)的研究進(jìn)展

脊柱損傷被認(rèn)為是一種不可治愈的疾病，但近年來(lái)的病理生理研究加深了對(duì)脊柱損傷修復(fù)因素的理解，細(xì)胞生物學(xué)和生物學(xué)的發(fā)展為脊柱損傷的治療提供了新的手段，希望對(duì)脊柱損傷進(jìn)行治療。其中，細(xì)胞移植和基因治療是兩種最具前景的方法，也是當(dāng)前研究的重點(diǎn)和方向。一、髓突生長(zhǎng)的治療脊髓損傷后的修復(fù)面臨許多問(wèn)題,主要是損傷后脊髓中的環(huán)境不利于修復(fù)的發(fā)生和發(fā)展,如:(1)脊髓神經(jīng)元的死亡和缺乏修復(fù)能力;(2)促進(jìn)修復(fù)的因素如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的缺乏;(3)存在抑制修復(fù)的分子如NOGO、髓磷脂相關(guān)糖蛋白等;(4)膠質(zhì)瘢痕、空洞阻礙軸突生長(zhǎng)。脊髓損傷修復(fù)的策略就是針對(duì)這些因素加以干預(yù):減少受損細(xì)胞的變性和損失,細(xì)胞移植補(bǔ)充受損細(xì)胞;補(bǔ)充神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子;減少抑制性因子;減少瘢痕和空洞,提供軸突生長(zhǎng)的基質(zhì)。從脊髓損傷治療的策略來(lái)看,完全恢復(fù)脊髓功能非常困難而且并非必要,治療的目的應(yīng)該是恢復(fù)對(duì)生活質(zhì)量有重要作用的那一部分功能。各種脊髓損傷治療措施實(shí)現(xiàn)的難易程度有很大不同,從易到難依次為:再髓鞘化、殘存神經(jīng)元的軸突再生、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)和釋放、神經(jīng)元再生、軸突出芽和形成合適的突觸、遠(yuǎn)距離的軸突再生并精確連接到靶器官。目前來(lái)看最可能先達(dá)到的目標(biāo)可能是使變性但是沒(méi)有斷裂的軸突重新形成髓鞘恢復(fù)其功能,如果能夠恢復(fù)10%的功能性軸突連接就可以支持行走。所以研究?jī)?yōu)先考慮的重點(diǎn)應(yīng)該是髓鞘形成和軸突再生,而細(xì)胞移植和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的基因治療就是達(dá)到這種目的的主要手段。二、神經(jīng)細(xì)胞移植細(xì)胞移植可在脊髓損傷的多個(gè)方面起作用,如替代受損細(xì)胞如神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞,分泌促進(jìn)再生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,保護(hù)神經(jīng)元減輕繼發(fā)損傷,在脊髓損傷空洞區(qū)形成橋接引導(dǎo)神經(jīng)再生,酶解膠質(zhì)瘢痕,去除細(xì)胞碎片,調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),修復(fù)脊髓中的非神經(jīng)組織如血管等。目前可供選擇的細(xì)胞類型有胚胎干細(xì)胞(ES)、神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)、嗅鞘細(xì)胞(OEC)、雪旺細(xì)胞(Schwanncell)、成纖維細(xì)胞(Fibroblast)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)、巨噬細(xì)胞(Macrophage)等。胚胎干細(xì)胞有多向分化能力,McDonald用4-/4+RA方案誘導(dǎo)的ES向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化,可以使培養(yǎng)的細(xì)胞中90%以上為少突膠質(zhì)細(xì)胞。移植后細(xì)胞在脊髓空洞中生長(zhǎng)、增殖并向遠(yuǎn)處遷移,分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞(60%)、神經(jīng)元(10%)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(30%),表達(dá)髓磷脂、髓磷脂堿性蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)成分纖維連接素和層粘連蛋白,使得軸突髓鞘形成,提高運(yùn)動(dòng)功能。通過(guò)體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù),將來(lái)有可能培養(yǎng)出帶有患者自身染色體的ES細(xì)胞,解決目前存在的ES細(xì)胞來(lái)源和免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題。神經(jīng)干細(xì)胞成體動(dòng)物脊髓內(nèi)存在神經(jīng)干(前體)細(xì)胞,而且在損傷后可以激活和增殖,但是不足以完成修復(fù)過(guò)程,需要補(bǔ)充外源性神經(jīng)干細(xì)胞。NSC移植后主要分化成為膠質(zhì)細(xì)胞引導(dǎo)髓鞘形成,部分分化成為神經(jīng)元形成突觸連接。有少部分分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞,形成髓鞘,主要是外周型髓鞘,集中在損傷部位。在和正常區(qū)域交接的部位新生的髓鞘終止延長(zhǎng),所以不會(huì)干擾正常的軸突功能。我們用NSC移植到損傷脊髓后,發(fā)現(xiàn)NSC可以存活,減小脊髓空洞,提高運(yùn)動(dòng)功能。嗅鞘細(xì)胞起源于嗅基底膜,分布在嗅球、嗅神經(jīng)并可伴隨嗅束遷徙入腦。它不同于星形細(xì)胞和雪旺氏細(xì)胞,但同時(shí)具有這兩種細(xì)胞的特性,它存在并遷徙于周圍神經(jīng)和中樞神經(jīng)之間,可以穿越外周神經(jīng)/中樞神經(jīng)屏障。在整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)通路中,它包被嗅神經(jīng)軸突,以防止它們與其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞接觸。OEC能分泌大量不同種類的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和支持因子如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)等,在其膜上表達(dá)出很多與細(xì)胞黏合和軸突生長(zhǎng)相關(guān)的分子和促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因素的分子如L1、PSA-N-CAM、N-CAM、laminin、fibronectin。OEC可以自體取材移植,當(dāng)嗅鞘細(xì)胞被移植入成年鼠的脊髓損傷區(qū)內(nèi),它們能與宿主神經(jīng)實(shí)體組織結(jié)合為一體,抑制瘢痕和空洞的形成,幫助再生神經(jīng)軸突穿過(guò)抑制屏障如膠質(zhì)組織,并隨再生神經(jīng)軸突遷徙到特殊靶點(diǎn)。在神經(jīng)脫髓鞘的情況下,嗅鞘細(xì)胞能幫助神經(jīng)髓鞘化和加速神經(jīng)電生理傳導(dǎo)速度。和雪旺細(xì)胞移植相比,OEC能和星形膠質(zhì)細(xì)胞很好的整合,不引起星形膠質(zhì)細(xì)胞的肥大和表達(dá)硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPG)的上調(diào),減少星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生和蛋白多糖的表達(dá),促進(jìn)運(yùn)動(dòng)刺激電位恢復(fù)的能力更強(qiáng)。雪旺細(xì)胞,脊髓損傷特別是有硬脊膜破裂后有雪旺細(xì)胞遷移到脊髓中,但是一般形成“雪旺細(xì)胞瘤”,沒(méi)有形成髓鞘。雪旺細(xì)胞移植后,可以在脊髓中形成髓鞘,這種髓鞘和脊髓本身的有區(qū)別,含有大的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì),有基膜和細(xì)胞外膠原沉積,雪旺細(xì)胞移植后脊髓的傳導(dǎo)速度加快,引導(dǎo)軸突通過(guò)移植細(xì)胞并且長(zhǎng)入遠(yuǎn)端脊髓中。雪旺細(xì)胞能自體取材和大量擴(kuò)增,能夠使髓鞘再生,但是它和星形膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用阻礙了其在脊髓損傷修復(fù)中的作用。到達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞的邊界后雪旺細(xì)胞停止生長(zhǎng)和遷移,能夠引導(dǎo)軸突長(zhǎng)入,但是不能使軸突穿越移植物到達(dá)遠(yuǎn)端脊髓。加用咯利普蘭(rolipram)和雙丁酰環(huán)腺苷酸(db-cAMP)后,移植的雪旺細(xì)胞增加了損傷部位的軸突數(shù)量并且使其穿越損傷部位達(dá)到遠(yuǎn)端脊髓,增加了神經(jīng)元數(shù)量和髓磷脂含量,可使脊髓挫傷成年大鼠恢復(fù)70%的正常行走功能。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種成體干細(xì)胞,能誘導(dǎo)成為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞,能分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞因子和其他生物活性因子。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BMSC能分泌BDNF和NGF,移植到脊髓后能減輕細(xì)胞凋亡,減少脊髓空洞,促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。BMSC注射到脫髓鞘的SCI模型中,能促進(jìn)髓鞘形成,主要為表現(xiàn)為周圍型髓鞘,但有少部分(3%)形成的髓鞘和少突膠質(zhì)細(xì)胞類似。成纖維細(xì)胞主要是作為基因的載體細(xì)胞,它本身也可以表達(dá)支持神經(jīng)元和軸突的細(xì)胞外基質(zhì)如纖維連接素等,有容易培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染基因的優(yōu)點(diǎn)。其他如巨噬細(xì)胞移植后能吞噬變性的軸突和髓磷脂,減小脊髓空洞,分泌BDNF等因子,促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。三、mds-gf在髓中的常用模型神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在促進(jìn)脊髓損傷恢復(fù)中起重要作用,可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞減少其損失,促進(jìn)髓鞘形成和軸突再生。脊髓損傷進(jìn)行細(xì)胞移植治療后,局部和移植的細(xì)胞既可以分泌多種促進(jìn)神經(jīng)損傷恢復(fù)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,又產(chǎn)生抑制軸突生長(zhǎng)的分子,這兩種相互對(duì)抗的因子處于平衡狀態(tài),所以神經(jīng)再生是有限的,要進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)的再生需要額外補(bǔ)充有促進(jìn)作用的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。目前臨床主要通過(guò)靜脈注射某些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,但由于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是生物大分子,難以通過(guò)血腦屏障,而且全身使用效率低。通過(guò)微泵在局部使用可以提高效率,但是使用不方便且不能長(zhǎng)期使用?；蛑委熆蓪⑸窠?jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因?qū)塍w內(nèi),在局部長(zhǎng)期產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,具有局部濃度高、分泌的時(shí)間、空間可調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)?；蛑委煱╥nvivo和exvixo等方式,exvixo同時(shí)具有細(xì)胞移植的基因治療的雙重優(yōu)點(diǎn)。將目標(biāo)基因?qū)氲郊?xì)胞有物理化學(xué)方法(如陽(yáng)離子脂質(zhì)體等)和生物方法。用陽(yáng)離子脂質(zhì)體等可以直接將基因轉(zhuǎn)到體內(nèi)(invivo),但是轉(zhuǎn)染的效率低,基因的表達(dá)是暫時(shí)的。病毒載體是主要的發(fā)展方向,現(xiàn)在常用的病毒載體有單純皰疹病毒(HSV)、腺病毒(AdV)、腺相關(guān)病毒(AAV)和慢病毒(LV)載體。單純皰疹病毒載體的優(yōu)點(diǎn)是具有神經(jīng)親合性,在神經(jīng)元內(nèi)可以長(zhǎng)時(shí)間潛伏,載體容量大,可以從注射部位逆向運(yùn)輸?shù)缴窠?jīng)元。缺點(diǎn)是對(duì)除了感覺(jué)神經(jīng)元外的其他神經(jīng)元轉(zhuǎn)染效率低,瞬時(shí)表達(dá),有一定的毒力。腺病毒載體可以攜帶多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因有效地轉(zhuǎn)染神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞,但是它也是瞬時(shí)表達(dá),也有一定的毒力。腺相關(guān)病毒載體的蛋白編碼序列被完全去除,因此克服了AdV和HSV的免疫原性和神經(jīng)毒性。慢病毒載體最先源于HIV,屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,可以轉(zhuǎn)染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞,基因插入染色體穩(wěn)定表達(dá),維持高表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)答6個(gè)月以上,免疫原性小,但是有導(dǎo)致染色體插入誘變的可能。NGF是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,主要作用于感覺(jué)、交感神經(jīng)。分泌NGF的成纖維細(xì)胞移植到脊髓后,可以引起脊髓初級(jí)感覺(jué)傳入神經(jīng)軸突、局部運(yùn)動(dòng)神經(jīng)軸突、藍(lán)斑核脊髓軸突的出芽,但是皮質(zhì)脊髓束軸突沒(méi)有變化。出芽的軸突可以生長(zhǎng)到移植細(xì)胞內(nèi),但是不能穿越到達(dá)遠(yuǎn)端脊髓組織。Neurotrophin-3(NT-3)是在脊髓中作用最強(qiáng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。NT-3轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞移植到慢性脊髓損傷模型中,可以顯著地促進(jìn)皮質(zhì)脊髓束的再生,長(zhǎng)度達(dá)到15mm,促進(jìn)脊髓運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。NT-3轉(zhuǎn)染少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞后可以使其向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化,分泌髓鞘堿性蛋白的數(shù)量增加,并在共培養(yǎng)的神經(jīng)元周圍形成髓鞘。BDNF可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)和存活,主要作用于紅核脊髓束和紅核神經(jīng)元,能促進(jìn)脊髓損傷后紅核脊髓束的再生和功能恢復(fù)。BDNF可以抑制神經(jīng)元內(nèi)磷酸二酯酶的活性,通過(guò)Erk依賴的途徑提高細(xì)胞內(nèi)cAMP,增強(qiáng)軸突生長(zhǎng)能力,并且能夠克服軸突延長(zhǎng)的抑制物MAG的作用。GDNF能促進(jìn)運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)軸突生長(zhǎng),引導(dǎo)雪旺細(xì)胞遷移到損傷脊髓并使新生的軸突形成髓鞘。轉(zhuǎn)染GDNF后,移植的OEC在脊髓內(nèi)增加紅核脊髓束和皮質(zhì)脊髓束的軸突再生,促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植可以促進(jìn)和引導(dǎo)軸突長(zhǎng)入,但是軸突較少穿越移植物進(jìn)入到遠(yuǎn)端脊髓中,這種現(xiàn)象可能和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的持續(xù)分泌有關(guān)。所以需要控制神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá),上調(diào)表達(dá)使軸突長(zhǎng)入移植物中,然后當(dāng)軸突即將穿越移植物時(shí)下調(diào)基因表達(dá),使軸突穿過(guò)移植物長(zhǎng)入遠(yuǎn)端脊髓組織中。比如使用有四環(huán)素啟動(dòng)子載體轉(zhuǎn)染神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,讓動(dòng)物服用含強(qiáng)力霉素使導(dǎo)入體內(nèi)的基因表達(dá)下調(diào)。四、細(xì)胞移植和基因治療綜上所述,細(xì)胞移植和基因治療是脊髓損傷治療的重要手段,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了好的效果,有很好的臨床應(yīng)用前景。但是目前的研究還需要進(jìn)一步的深入,如在細(xì)胞移植治療方面還需要研究:胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞移植前的定向分化調(diào)控;對(duì)多種細(xì)胞移植的效果進(jìn)行比較,挑選療效最佳的細(xì)胞類型;移植的時(shí)機(jī)和途徑的選擇;是否能將膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元按比例共同移植以提高療效等等。在基因治療方面還需要研究:基因治療的安全性問(wèn)題;基因表達(dá)的時(shí)間、空間調(diào)控;多種因子的協(xié)調(diào)和序貫作用等。目前細(xì)胞移植和基因治療的效果還比較局限,將來(lái)還需要綜合其他多種治療方法取得更好的效果,如抑制繼發(fā)損傷、中和抑制性分子、電刺激和功能鍛煉等?，F(xiàn)在的研究多是在小動(dòng)物如大鼠、小鼠、貓等上進(jìn)行的,由于小動(dòng)物和人類在脊髓損傷后的病理