目的基因?qū)ｎ}知識(shí)

上節(jié)知識(shí)點(diǎn)回顧抗植物病毒基因工程中慣用技術(shù)路線。CP基因抗病毒原理。病毒衛(wèi)星RNA。缺點(diǎn)干擾顆粒。目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第1頁(yè)1.植物抗真菌病害基因植物防衛(wèi)反應(yīng)：

增強(qiáng)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)：

富含羥脯氨酸糖蛋白和富含甘氨酸蛋白；木質(zhì)素

誘導(dǎo)產(chǎn)生或激活抗菌物質(zhì)：

硫堇，植物抗毒素，幾丁質(zhì)酶，PR蛋白小麥銹病

梨黑星病目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第2頁(yè)

1.1幾丁質(zhì)酶基因

幾丁質(zhì)酶抑菌機(jī)制

植物病原真菌細(xì)胞壁主要成份之一是幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)酶經(jīng)過(guò)破壞菌絲尖端新合成幾丁質(zhì)而抑制病原菌生長(zhǎng)。病原真菌細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)降解不但破壞細(xì)胞新物質(zhì)沉積，使病原體死亡，而且產(chǎn)生細(xì)胞壁碎片能夠刺激寄主植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)。

幾丁質(zhì)酶屬于PR蛋白，在植物中含量低，受病原菌誘導(dǎo)，沒(méi)有病原特異性，是由宿主反應(yīng)類型決定，在進(jìn)化上相對(duì)保守。目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第3頁(yè)幾丁質(zhì)酶利用策略直接應(yīng)用，將酶直接施與農(nóng)田，以保護(hù)植物免受土壤真菌侵染將幾丁質(zhì)酶基因引入根圍細(xì)菌，使該工程菌表示分泌幾丁質(zhì)酶將基因?qū)胫参?，使轉(zhuǎn)基因植物表示幾丁質(zhì)酶。

現(xiàn)在已經(jīng)對(duì)許多微生物和植物幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行了分離，克隆，測(cè)序和轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因植株中幾丁質(zhì)酶增加，抗病性增加。目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第4頁(yè)1.2植物抗毒素基因

植物抗毒素：亦稱植保素，是植物受侵染后產(chǎn)生一類低分子抗菌化合物，含有種屬特異性。

現(xiàn)已判定植保素達(dá)200各種，以類黃酮與類萜類植保素研究最多。植保素產(chǎn)生速度、累積含量與植物抗病性有著親密關(guān)系。目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第5頁(yè)1.3過(guò)氧化物酶基因苯丙烷代謝是一條和各種生理功效親密相關(guān)代謝路徑。該路徑產(chǎn)物在植物抗病反應(yīng)中起著主要作用。（預(yù)防性抗菌物質(zhì)、誘導(dǎo)性抗病物質(zhì)、防御屏障）

過(guò)氧化物酶催化苯基類丙烷醇脫氫聚合最終形成木質(zhì)素，將該酶編碼基因和35s開(kāi)啟子連接轉(zhuǎn)入煙草，顯著提升了煙草對(duì)霜霉病抗性。目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第6頁(yè)1.4SAR抗病基因SAR概念：系統(tǒng)取得抗病系統(tǒng)，由病原侵染激發(fā)，可連續(xù)及對(duì)隨即同種病原體甚至不一樣種其它病原體侵染均能表現(xiàn)出系統(tǒng)性抗病性。水楊酸（SA）：一個(gè)信號(hào)分子，SA介導(dǎo)植物保護(hù)反應(yīng)是因?yàn)橐唤M復(fù)雜植物保護(hù)機(jī)制被SA激活所致。（足夠SA含量+有效信號(hào)感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑）。過(guò)氧化氫酶：在病原菌與寄主識(shí)別反應(yīng)早期就會(huì)積累過(guò)氧化氫酶是SA結(jié)合蛋白，該酶基因過(guò)表示能夠增加馬鈴薯抵抗病原菌能力。目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第7頁(yè)2.抗植物細(xì)菌病害基因全世界馬鈴薯每年因細(xì)菌病害減產(chǎn)25%，約40億美元。

1845-1860年馬鈴薯晚疫病造成愛(ài)爾蘭饑荒。

1970年玉米大斑病再次引發(fā)全球驚慌。目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第8頁(yè)2.1病原菌本身抗性基因

原理：將病原菌基因?qū)胫参锛?xì)胞，使其過(guò)量表示，或表示失去原有功效蛋白，或表示失去原有時(shí)空性，從而干擾病原菌正常生理代謝，以致寄主植物表現(xiàn)出抗性。

菜豆毒素是菜豆假單胞菌中主要治病因子，作用機(jī)制是抑制植物鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶（OCTase）活性。菌體本身存在抗菜豆毒素OCTase，將編碼該酶基因?qū)霟煵莺?，取得煙草轉(zhuǎn)基因植株在接種菜豆毒素后不表現(xiàn)系統(tǒng)病癥。目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第9頁(yè)轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因甜椒轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因馬鈴薯目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第10頁(yè)2.2溶菌酶基因及其應(yīng)用溶菌酶（lysozyme）存在于卵清、唾液等生物分泌液中，催化細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖N-乙酰氨基葡糖與N-乙酰胞壁酸之間1，4-β-糖苷鍵水解酶。所以，該酶含有抗菌、消炎、抗病毒等作用。目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第11頁(yè)3.抗非生物脅迫基因脅迫：指對(duì)植物生存和生長(zhǎng)不利各種環(huán)境原因總和。分為生物脅迫和非生物脅迫。風(fēng)、雨、雪、聲、磁、電化學(xué)原因鹽類、離子、氣體、除草劑等輻射紅外光可見(jiàn)光紫外光離子輻射水澇干旱溫度低溫高溫冷害凍害蘇鐵凍害目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第12頁(yè)農(nóng)田雜草叢生香蕉除草劑藥害農(nóng)田雜草叢生玉米除草劑藥害限制除草劑應(yīng)用主要原因：除草劑藥害3.1耐除草劑基因目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第13頁(yè)

主要為轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花、油菜，5860萬(wàn)hm2，約占全世界轉(zhuǎn)基因作物72%目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第14頁(yè)處理除草劑對(duì)農(nóng)作物傷害路徑（二）育種

1.雜交育種：將野草植物除草劑抗性引入栽培品種中；

2.遺傳工程育種：組培或細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)合理化誘變

基因工程伎倆（一）應(yīng)用對(duì)農(nóng)作物傷害小除草劑耐除草劑基因工程策略：靶蛋白改造；引入酶系統(tǒng)目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第15頁(yè)3.1.1靶蛋白抗性基因及其應(yīng)用（1）抗EPSPS抑制劑基因及其應(yīng)用EPSPS：草甘膦（glyphosate）是一個(gè)施用于葉片廣譜、非選擇性有機(jī)磷類除草劑。草甘膦特異性地抑制植物和細(xì)菌中5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）活性。EPSPS是芳香族氨基酸合成路徑中一個(gè)酶，對(duì)植物正常發(fā)育起著主要作用。EPSPS過(guò)量表示EPSPS靶蛋白突變目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第16頁(yè)（2）抗ALS抑制劑基因及其應(yīng)用ALS：乙酰乳酸合成酶?；酋ｋ孱惓輨┙?jīng)過(guò)抑制支鏈氨基酸合成過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵酶ALS來(lái)表現(xiàn)其除草劑作用。植物中ALS對(duì)磺酰脲類除草劑抑制作用相當(dāng)敏感。

ALS靶點(diǎn)突變體在自然界普遍存在，ALS基因上許多位點(diǎn)能夠產(chǎn)生突變體并賦予抗性。將擬南芥中抗除草劑基因（ALS基因突變基因）導(dǎo)入煙草，轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)磺酰脲類除草劑敏感性下降了約1000倍。3.1.1靶蛋白抗性基因及其應(yīng)用目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第17頁(yè)

有許多不一樣酶系統(tǒng)對(duì)除草劑有降解作用，這些酶系統(tǒng)存在于作物、雜草和微生物中。

降解抗性可能包括多于一個(gè)基因或物質(zhì)參加，分離對(duì)除草劑有降解作用基因較困難。不過(guò)降解系統(tǒng)產(chǎn)生對(duì)除草劑抗性專一性強(qiáng)、效率高、負(fù)效應(yīng)小。3.1.2除草劑降解和解毒基因及其應(yīng)用目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第18頁(yè)

（1）乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶基因及其應(yīng)用

乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶含有使除草劑草丁膦失活作用。在CoA存在情況下，乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶催化乙酰CoA與草丁膦游離氨基酸結(jié)合，使L-草丁膦轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴?L-草丁膦，從而失去除草劑活性。

從鏈霉菌中分離到乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因（bar）轉(zhuǎn)入煙草、馬鈴薯和番茄中，取得抗Basta植株，而且產(chǎn)量不受影響。3.1.2除草劑降解和解毒基因及其應(yīng)用目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第19頁(yè)（2）超氧化物酶歧化酶基因許多除草劑（百草枯）在植物體內(nèi)產(chǎn)生活性氧并氧化植物細(xì)胞質(zhì)膜而造成植物死亡。把高效開(kāi)啟子控制下SOD基因?qū)胫参?，能夠提升植物抗逆性?.1.2除草劑降解和解毒基因及其應(yīng)用目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第20頁(yè)降解或解毒策略能夠作為修飾或過(guò)表示靶蛋白一個(gè)有價(jià)值替換方法。解毒酶基因還可能賦予植物對(duì)各種除草劑耐性。

抑制植物對(duì)除草劑吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)含有很大前景，不過(guò)還是一個(gè)構(gòu)想。目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第21頁(yè)3.2抗其它非生物脅迫基因第一類基因編碼產(chǎn)物是在植物抗性中直接起保護(hù)作用蛋白質(zhì)。1.合成滲透調(diào)整物質(zhì)關(guān)鍵酶類，2.含有解毒作用酶，3.保護(hù)生物大分子及膜結(jié)構(gòu)蛋白，4.具保護(hù)作用蛋白酶，5.水通道蛋白。第二類基因編碼產(chǎn)物是在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆激基因表示過(guò)程中起調(diào)整作用蛋白質(zhì)因子。1.傳遞信號(hào)和調(diào)控基因表示轉(zhuǎn)錄因子，2.感應(yīng)和轉(zhuǎn)導(dǎo)脅迫信號(hào)蛋白激酶，3.與第二信使生成相關(guān)酶。目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第22頁(yè)3.2.1滲透調(diào)整物質(zhì)合成酶基因滲透調(diào)整物質(zhì)：植物在高鹽或干旱條件下，為了消除脅迫所造成傷害，維持滲透平衡和體內(nèi)水分，在細(xì)胞中產(chǎn)生和積累一些小分子化合物。氨基酸衍生物，脯氨酸、甜菜堿；糖類，海藻糖、果聚糖，多醇類。其中海藻糖、甜菜堿是次生代謝產(chǎn)物。目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第23頁(yè)3.2.2保護(hù)生物大分子及膜結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)基因（1）抗凍蛋白基因抗凍蛋白（antifreezeprotein，AFP）：指能降低冰點(diǎn)和降低冰晶生長(zhǎng)速度蛋白質(zhì)。

用魚(yú)類AFP處理植物組織細(xì)胞，能夠降低細(xì)胞冰晶生長(zhǎng)，降低冰凍溫度。

表示黃蓋鰈AFP基因番茄和煙草轉(zhuǎn)基因植株抗凍性增加。熒光抗凍蛋白裝飾冰晶體目的基因?qū)ｎ}知識(shí)第24頁(yè)（2）胚胎發(fā)生后期富集蛋白基因3.2.2保護(hù)生物大分子及膜結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)基因

胚胎發(fā)生后期