吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡_第1頁(yè)
吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡_第2頁(yè)
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吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第1頁(yè)試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)與要求1、掌握吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡原理和操作方法2、掌握熒光顯微鏡原理與操作方法吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第2頁(yè)凋亡起始:細(xì)胞表面特化結(jié)構(gòu)消失,細(xì)胞皺縮,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹與質(zhì)膜融合,染色質(zhì)固縮和降解。凋亡小體形成:細(xì)胞核分裂,與細(xì)胞質(zhì)一起形成芽狀突起,逐步與細(xì)胞分離。凋亡小體被吞噬:試驗(yàn)原理凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制細(xì)胞自主有序死亡。吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第3頁(yè)吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第4頁(yè)吖啶橙染色原理吖啶橙(AcridineOrange)是一個(gè)熒光染料,它與雙鏈DNA結(jié)合方式是嵌入雙鏈之間,而與單鏈DNA和RNA則由靜電吸引堆積在其磷酸根上。在藍(lán)光(約502nm)激發(fā)下,細(xì)胞核發(fā)亮綠色熒光(約530nm),核仁和胞質(zhì)RNA發(fā)桔紅色熒光(>580nm)。吖啶橙陽(yáng)離子也能夠結(jié)合在蛋白質(zhì)、多糖和膜上而發(fā)熒光,但細(xì)胞固定阻抑了這種結(jié)合,從而主要顯示DNA、RNA兩種核酸。正常細(xì)胞核因含DNA顯示黃綠色熒光,細(xì)胞質(zhì)與核仁都顯示橘紅色熒光,細(xì)胞體積較大且鋪展。凋亡細(xì)胞體積顯著縮小,核呈黃綠色,斷裂為多個(gè)碎塊狀,無(wú)核仁,碎裂核由膜包裹著凸起于細(xì)胞表面呈黃綠色。吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第5頁(yè)吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第6頁(yè)熒光顯微鏡吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第7頁(yè)熒光顯微鏡成像原理熒光顯微鏡是利用一定波長(zhǎng)激發(fā)光對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā),使之產(chǎn)生一定波長(zhǎng)熒光,從而用于對(duì)樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測(cè)。物質(zhì)吸收短波光,發(fā)射出長(zhǎng)波光。吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第8頁(yè)吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第9頁(yè)反射熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡汞燈紫外線保護(hù)罩孔徑光欄(FS)視場(chǎng)光欄(AS)吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第10頁(yè)落射熒光顯微鏡各部件特征和作用

汞燈光源:提供激發(fā)光(U、V、B、G)

激發(fā)濾色鏡:

波長(zhǎng)選擇nmT%BANDPASS吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第11頁(yè)落射熒光顯微鏡各部件特征和作用

吸收濾色鏡:透過熒光,阻擋雜光

分色鏡:反射激發(fā)光,透過熒光>A透過A<A反射B>B透過<B阻擋nmnmT%T%吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第12頁(yè)反射熒光顯微鏡原理汞燈激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡物鏡

標(biāo)本吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第13頁(yè)濾色鏡選擇激發(fā)濾色鏡吸收濾色鏡FITC吸收FITC發(fā)射分色鏡吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第14頁(yè)濾色鏡:對(duì)一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)光線進(jìn)行選擇性吸收或透過儀器。激發(fā)濾色鏡:

UV:340-380nmV:390-460nm

B:460-500nmG:500-570nm分色鏡:將入射光個(gè)別波長(zhǎng)范圍光反射,其余個(gè)別透過反射鏡。吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第15頁(yè)濾色鏡選擇熒光素特征濾色鏡特征激發(fā)分色吸收吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第16頁(yè)①取細(xì)胞爬片,PBS液漂洗2次,晾干。

②95%乙醇溶液固定5min。

③滴加0.01%吖啶橙染液染色5min。

④PBS液暫時(shí)封固(取1張潔凈載玻片,滴1滴PBS液,將染色好飛片細(xì)胞面朝下放在載玻片液滴處),

⑤選擇紫藍(lán)光激發(fā)濾片,熒光顯微鏡觀察。試驗(yàn)步驟制備細(xì)胞爬片胰酶消化蓋玻片培養(yǎng)紫外照射10min培養(yǎng)12h細(xì)胞凋亡檢測(cè):誘導(dǎo)凋亡吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第17頁(yè)觀察:用藍(lán)紫光濾光片,可見經(jīng)0.01%丫啶橙熒光染料染色細(xì)胞,細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生兩種不一樣顏色熒光(亮綠色或暗綠色、橙紅色)吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第18頁(yè)反射熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)優(yōu)點(diǎn):

因?yàn)槲镧R兼作聚光鏡,不需要很多調(diào)整。物鏡數(shù)值孔徑不受限制,在高放大被率時(shí),也能夠取得高分辨率像。厚或不透明標(biāo)本也能觀察,厚蓋玻片也能使用。其它觀察法也能與反射熒光結(jié)合使用,尤其和相差法和透射微分干涉差法相結(jié)合。能夠防止無(wú)須要熒光色衰褪現(xiàn)象。吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第19頁(yè)缺點(diǎn):在用低倍率物鏡時(shí),像比較暗,所以必須用大數(shù)值孔徑物鏡。濾光鏡系統(tǒng)必須有效地分離開激發(fā)光和熒光。吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第20頁(yè)激發(fā)熒光方式:按光波長(zhǎng)范圍分為UV激發(fā)法(使用紫外線照明法)和BV激發(fā)法(使用藍(lán)紫光)兩種。UV激發(fā)法是用短于400nm近紫外光進(jìn)行激發(fā)。該法不存在可見激發(fā)光,所以被觀察熒光展現(xiàn)該染料固有熒光,輕易判別標(biāo)本上特異熒光和背景組織本身熒光。吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第21頁(yè)BV激發(fā)法是以404nm、434nm為中心由紫外至藍(lán)光進(jìn)行激發(fā)。該方法使用藍(lán)光照射標(biāo)本,所以熒光觀察系統(tǒng)截止濾光片必須使用可完全阻斷藍(lán)光并可充分經(jīng)過所需綠、黃熒光濾光片。吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第22頁(yè)用于熒光抗體法熒光色素,對(duì)于激發(fā)光極大吸收波長(zhǎng)和熒光極大發(fā)光波長(zhǎng)比較靠近,所以BV激發(fā)法使用濾光片必須使用銳截止式濾光片。該法可用藍(lán)光作為激發(fā)光,所以熒光色素吸收效率較高,可得到較明亮圖像。吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第23頁(yè)其缺點(diǎn)是500nm以下熒光無(wú)法看到,而500nm以上使整個(gè)圖像顯黃色。在熒光抗體法中,大多以熒光色素特有顏色來(lái)判斷其特異性,所以在討論微妙特異性時(shí),上述BV激發(fā)法缺點(diǎn)往往影響極大。吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第24頁(yè)熒光顯微鏡照明可依據(jù)聚光器結(jié)構(gòu)和激發(fā)光波長(zhǎng)按以下三點(diǎn)考慮:

①?gòu)臒晒庀穹床钜髞?lái)看,UV激發(fā)暗場(chǎng)聚光器照明最好。

②以像亮度來(lái)考慮,BV激發(fā)濾光片暗場(chǎng)觀察效率最高。

吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第25頁(yè)③UV激發(fā)濾光片暗場(chǎng)觀察和BV激發(fā)暗場(chǎng)聚光器照明特征,可看作介于這兩種照明方法之間,但前者濾光片暗場(chǎng)性質(zhì)較強(qiáng),顯示圖像較明亮,反差??;后者因保留暗場(chǎng)光路性質(zhì),故顯示圖像較暗,而反差有所改進(jìn)。當(dāng)實(shí)際使用熒光顯微鏡時(shí),應(yīng)采取最適合標(biāo)本要求照明法進(jìn)行觀察。吖啶橙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡第26頁(yè)

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