火龍果中多糖及其他次生代謝產(chǎn)物的提取

火龍果中多糖及其他次生代謝產(chǎn)物的提取

0dna分子標記的應用龍眼又名紅龍果、仙蜜果、情人果等，是仙人掌科的一種具有天然尺和三角柱的植物。它來自中國大陸。這是亞熱帶和亞熱帶的著名水果。目前各地栽培種植的火龍果主要有紅皮紅肉、紅皮白肉以及黃皮白肉系列,筆者在進行火龍果引種研究中發(fā)現(xiàn),各系列尚有許多表征不同的類型,且各類型間在產(chǎn)量、品質(zhì)等方面都表現(xiàn)出一定差異。為了進一步明確各類型的遺傳差異性,則需要應用DNA分子標記進行分子評價及種質(zhì)分析。目前植物分子標記的研究多采用ISSR進行,它是由Zietkiewics等提出的一種錨定SSR的新策略,是建立在PCR反應基礎上的一種新型分子標記技術試驗以火龍果嫩莖為試材,通過多種DNA提取方法比較研究,旨在尋求火龍果基因組總DNA提取的有效方法,以便更好地進行火龍果各類型遺傳背景研究。1材料和方法1.1試材的選擇火龍果樣品采自福清三華農(nóng)業(yè)有限公司的火龍果生產(chǎn)基地,選取紅皮深紅色果肉與紅皮白肉的火龍果嫩莖作為試材。樣品采集后裝于自封袋中并做好標記,置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2dycp-33a型電泳槽臺式高速冷凍離心機(Beckman),TU-1810紫外可見分光光度計,恒溫水浴鍋,DYCP-33A型電泳槽,DYY-6C型電泳儀,SyngeneGeneGenius凝膠成像系統(tǒng),超低溫冰箱等。所用試劑中DNAMarker為TaKaRa公司產(chǎn)品,RNaseA為sigma公司產(chǎn)品,其余均為國產(chǎn)分析純試劑。1.3總提取方法1.3.1傳統(tǒng)ctag法1.3.2萃取ctab法1)稱取火龍果嫩莖1.0g,加入0.1gPVPP于冰冷的研缽中用液氮研磨成細粉,裝入10mL滅菌的離心管中。2)迅速加入65℃預熱的CTAB提取緩沖液(50mmol/LTris-HCl;20mmol/LEDTA;1.4mol/LNaCl;2%CTAB,臨時前加入2%β-巰基乙醇)4mL,混勻,在65℃水浴中溫浴裂解45min,期間不斷搖勻,每隔10min搖動1次。3)4℃下12000g離心20min。4)將上清液轉入到潔凈的滅菌離心管中,加入等體積氯仿-異戊醇(24:1)抽提,將其上下顛倒混勻,4℃12000g離心10min,取上清液。5)將上清液小心轉移到新的離心管中,加入2/3體積的-20℃預冷的異丙醇,輕輕搖動,使其充分混勻,置于-20℃下30min。6)4℃下13000g離心10min,棄上清液,可見絮狀沉淀,即為DNA沉淀,用牙簽挑出,裝入0.5mL離心管。1.3.3離心液-異戊醇法1)稱取火龍果嫩莖0.1g,加入PVPP于冰冷的研缽中用液氮研磨成細粉,裝入1.5mL滅菌的離心管中。2)迅速加入70℃預熱的CTAB提取緩沖液(100mmol/LTris-HCl;20mmol/LEDTA;1.4mol/LNaCl;2%CTAB;5mmol/LAscorbicacid;4mmol/LDIECA)600mL,并加入10μLβ-巰基乙醇,混勻,在振蕩器上振蕩20s。3)加入等體積的氯仿-異戊醇(24:1)抽提,將其上下顛倒混勻,并輕輕振蕩,常溫10000g離心5min,取上清液。4)將上清液轉入到潔凈的滅菌離心管中,加入2/3體積或等體積的-20℃預冷的異丙醇,輕輕搖動,使其充分混勻,置于-20℃下5min。5)4℃下14000g離心20min,棄上清液,可見絮狀沉淀,即為DNA沉淀。1.4凝膠電泳取少量上述提取的DNA溶液,在紫外分光光度計下測定波長260nm、280nm的吸光值OD取微量的火龍果DNA點樣于0.8%~1.0%的瓊脂糖凝膠電泳中進行電泳,在電壓130V、電流300A電泳30min,EB(溴化乙錠)染色15min,凝膠成像掃描保存。2結果與分析2.1dna的降解試驗所提取的火龍果DNA為白色或透明絮狀沉淀。通過電泳圖譜(圖1~3)可看出,3種方法提取總DNA的效果各有不同。如圖1所示,常規(guī)CTAB法提取火龍果總DNA的效果最差,電泳后無主帶產(chǎn)生,說明DNA未良好提取或在提取過程中已降解,同時還有未降解完全的RNA存在。而改良CTAB法與微量CTAB法提取火龍果總DNA較常規(guī)CTAB法效果好,均能有效提取到DNA,電泳圖譜主帶清晰,說明所提取的DNA完整性較好,基本上無斷裂。此外,試驗圖譜顯示(如圖2),改良CTAB法點樣孔有點亮,這說明該樣品中仍含有未被除去的多糖及其他一些次生代謝物質(zhì),這些物質(zhì)具有粘連性,從而使得DNA分子無法全部離開點樣孔或電泳速度較慢,在點樣孔上形成亮點,同時,RNA沒有去除干凈,因而有兩條帶。微量CTAB法所提取的DNA呈現(xiàn)一條清晰整齊的主帶(見圖3),DNA基本無降解現(xiàn)象,RNA降解完全,說明該方法能有效去除火龍果嫩莖中的多糖及其他次生代謝物質(zhì),為火龍果總DNA提取的有效方法。試驗顯示不同火龍果類型間存在一定的差異,深紅果肉火龍果提取的DNA效果要優(yōu)于白肉火龍果。2.2紫外分光光度計檢測結果將試驗中3種不同的方法提取的火龍果DNA,應用紫外分光光度計進行吸光值檢測,其結果如表1。傳統(tǒng)CTAB法提取得到的DNA溶液進行紫外分光光度計檢測無法獲得有效值,說明DNA基本已經(jīng)降解,與電泳檢測結果相同。而用改良CTAB法和微量CTAB法所提取的DNA溶液其OD3dna的提取不同的植物種類DNA提取的難易不同,此外,試材選擇、提取方法、操作技術、環(huán)境因素等也會對DNA的提取結果產(chǎn)生影響。該試驗研究表明,用微量CTAB法可以簡便、快速地從火龍果嫩莖中提取到適合于進行ISSR分析的DNA。而傳統(tǒng)CTAB法無法提取到理想的火龍果DNA,這可能與火龍果本身的特性有關,如它的植株材料中含有較多的次生代謝物質(zhì)、多糖以及植醇等。在進行火龍果總DNA提取時要注意以下幾個方面。見Shen等針對火龍果多糖、粘稠的特性,參考有關基因組DNA提取的資料7)用75%乙醇洗2遍,吹干,加入100μLTEBuffer(10mmol/LTris-HCl,pH8.0;10mmol/LEDTA,pH8.0)溶解,放置在-20℃冰箱中保存。由于火龍果莖黏性大,樣品多時對研磨轉管不利,在參考一些有關植物DNA微量提取法的文獻[10-11]后,進行了適當?shù)母倪M。具體步驟如下:6)用75%乙醇洗沉淀2遍,吹干,加入100μLTEBuffer(10mmol/LTris-HCl,pH8.0;10mmol/LEDTA,pH8.0)溶解,放置在-20℃冰箱中保存。1不同立地條件對dna提取的影響有研究表明,植物組織中的多糖或酚、酯、萜等次生代謝物質(zhì)會對DNA提取造成較大的困難,樣品不純,會抑制后續(xù)酶解和PCR反應,并且這些物質(zhì)隨著植物組織的增長而增加2研磨和離心管制備對于植物的DNA提取而言,充分研磨可破碎細胞壁和細胞膜使DNA釋放到提取緩沖液中?；瘕埞矍o中含有大量粘液狀的物質(zhì),因此要求研磨時要迅速,加入液氮后動作要快,邊研磨邊補充液氮,勿讓材料融化,防治其粘在研缽底部,影響轉管。研磨要越細越好,當獲得白綠色的粉末后要立即轉入離心管,否則就會變粘稠而影響后面的裂解。細胞裂解是細胞釋放DNA的前提。在微量CTAB法中,要求在得到粉末后立即加入預熱的CTAB提取緩沖液并振蕩,振蕩可使其充分混勻,以便及時鈍化組織破碎時DNA酶的活性;但是動作要盡量溫和,以免影響DNA得率。3得率失越大,得率越大通過比較研究發(fā)現(xiàn),試驗中間步驟越多,對DNA損失越大,得率越小。因此要盡量簡化步驟。同時,在試驗中,避免酚的使用,直接采用氯仿-異戊醇抽提,減少酚對人體的傷害以及殘留對后