熒光光譜分析方法及原理課件

參考書趙南明，周海夢.生物物理學(xué)，高等教育出版社，2000EmissionSpectroscopy,Chapter11,inK.E.vanHolde,W.C.JohnsonandP.S.Hoeds.PrinciplesofPhysicalBiochemistry,Prentice-Hall,1998參考書趙南明，周海夢.生物物理學(xué)，高等教育出版社，20001

某些物質(zhì)被一定波長的光照射時，會在一定時間內(nèi)發(fā)射出波長比入射光長的光，如果這個時間比較短，這種光就稱為熒光。熒光由一種能發(fā)熒光的礦物

螢石(fluospar)而得名。 我們這里要介紹的熒光，是指物質(zhì)在吸收紫外光和可見光后發(fā)出的波長較長的紫外熒光或可見熒光。 除了紫外光和可見光可能激發(fā)熒光外，其它的光如紅外光、X射線也可能激發(fā)出熒光，因此除紫外熒光或可見熒光外，還有紅外熒光、X射線熒光等。 某些物質(zhì)被一定波長的光照射時，會在一定時間內(nèi)發(fā)射出2

Indiscussingabsorptionwehavebeenconcernedentirelywiththeexcitationofamoleculefromitsgroundstatetoahigherenergylevelandhavegivennoconsiderationtothesubsequentfateoftheexcitedmolecule.

Inmanycasesthesequelisnotveryinteresting;theenergyistransferredasheattothesurroundings.

Insomecaseslightisemittedbythesampleeitherasfluorescenceorphosphorescence.

Wewilldiscussthegeneralcharacteristicsofemissionandignoretheexceptions.Indiscussingabsorptionweh3熒光光譜的特點熒光光譜的特點4BarakandWebbdemonstratedthatasfewas30fluorescentdyemoleculesboundtolowdensitylipoproteinmoleculescanbedetectedoncellsurfacesbymicroscopyusingasensitivevideocamera.Withevenmoresophisticatedmethodsothershavemovedtowarddetectionofsinglefluorophoremoleculesinalaser-excitedflowstream.Becausethissensitivitycancombinewitheaseofuseandthepotentialformultiparameteranalysis,fluorescencehasbecomewidelyusedinbiologyandmedicine.

FluorescenceisasensitivetechniquefordetectingbiologicalmaterialsBarakandWebbdemonstratedth5熒光光譜靈敏度高的原因

熒光輻射的波長比激發(fā)光波長長，測量到的熒光頻率與入射光的頻率不同； 熒光在各個方向上都有發(fā)射，因此可以在與入射光成直角的方向上檢測； 這樣，熒光不受來自激發(fā)光的本底的干擾，靈敏度大大高于紫外-可見吸收光譜，測量用的樣品量很少，且測量方法簡便。熒光光譜靈敏度高的原因 熒光輻射的波長比激發(fā)光波長長，測6熒光光譜能提供較多的參數(shù)，例如激發(fā)譜、發(fā)射譜、峰位、峰強度、熒光壽命、熒光偏振度等。熒光光譜還可以檢測一些紫外-可見吸收光譜檢測不到的時間過程過程。紫外和可見熒光涉及的是電子能級之間的躍遷，熒光產(chǎn)生包括兩個過程：吸收以及隨之而來的發(fā)射。每個過程發(fā)生的時間與躍遷頻率的倒數(shù)是同一時間量級(大約10-15秒)，但兩個過程中有一個時間延擱，大約為10-8秒，這段時間內(nèi)分子處于激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)的壽命取決于輻射與非輻射之間的競爭。由于熒光有一定的壽命，因此可以檢測一些時間過程與其壽命相當(dāng)?shù)倪^程。例如，生色團(tuán)及其環(huán)境的變化過程在紫外可見吸收的10-15秒的過程中基本上是靜止不變的，因此無法用紫外可見吸收光譜檢測，但可以用熒光光譜檢測。

熒光光譜第二個特點是信息量較大熒光光譜能提供較多的參數(shù)，例如激發(fā)譜、發(fā)射譜、峰位、峰強度、7基本原理基本原理8Fluorescence

Fluorescenceisemissionfromasingletstate,wheretheelectronspinsinthemoleculearepaired.

FluorescenceFluorescenceise9Fluorescenceexcitationbyabsorptionofenergylosesenergyasheatbyinternalconversionthemoleculehesitatesatthelowestvibrationallevelofthefirstsinglet,becausearelativelylargeamountofenergymustbelosttogotothegroundstate.duringthishesitationoneofthreethingsmayhappen:themoleculemayfluoresceitmayconverttothetriplet(intersystemcrossing)itmaygotothegroundstatewithoutemittingaphoton(anonradiativetransition).Fluorescenceexcitationbyabso10EMISSlONLlFETlMESEmissionlifetimesofabsorption,fluorescence,andphosphorescenceattheequilibriuminternucleardistanceofthegroundstate.EMISSlONLlFETlMESEmissionlif11儀器結(jié)構(gòu)儀器結(jié)構(gòu)12FLUORESCENCEINSTRUMENTATlONDiagramofasimplefluorescenceinstrumentFLUORESCENCEINSTRUMENTATlONDi13FilterFluorometersInstrumentsinwhichwavelengthselectionisaccomplishedwithfiltersaregenerallyreferredtoasfluorometers,whereasmonochromator-basedinstrumentscapableofspectralscanningarecalledspectrofluorometers.Thesimplest,leastexpensive,fluorometersaresinglebeamfilterinstrumentswithhalogenlampsources,phototubeorPMTdetectorsandsimpleoutputdevices.Ratiometricfluorometersarealsoavailableinwhichtheratioofthesamplesignaltoareferencesignalisusedinordertocompensateforfluctuationsinfinevoltage,drift,etc.

FilterFluorometers14Insomeinstruments,suchastheoneshowninfigure,thesampleandreferencelightpathsaretakenfromthesamesourceandalternatelymeasuredbythesamedetectorthroughtheuseofamechanicalcam.Asimilarconfigurationinwhichtwodetectorsareused,oneforthesamplebeamandoneforthereferencebeam,willcorrectforsourceoutputfluctuationsonly.Singledetectorconfigurationsarealsopossibletominimizeeffectsofdetectorvariability.

Insomeinstruments,suchast15Schematicdiagramofadouble-beam(ratiometric)filterfluorometer.

Schematicdiagramofadouble-16Filterfluorometersaresuitableforquantitativeanalysisapplicationsinwhichspectralscanningandhighresolutionarenotrequired.Filterstransmitmorelightandcostlessthanmonochromators,therebyprovidingbetterdetectionlimitswithlessexpensiveinstrumentation.Filterfluorometersaresuitab17Spectrofluorometers

Spectrofluorometersarealsoavailableinbothsinglebeamandratiometricconfigurations.AsinglebeaminstrumentisshowninFigure8.AratiometricspectrofluorometcrconfigurationinwhichtwoseparatedetectorsareemployedisdepictedinFigure9.ThereferencePMTmonitorstheexcitationbeamafterithaspassedthroughthemonochromatorsothatcorrectionsarebasedonfluctuationsinthewavelengthofinterestonly.ThereferencePMTisplacedafterthesampletomonitorthetransmittedbeam,therebyallowingabsorptionmeasurementstobemadeonthesample.Spectrofluorometers18Figure8Schematicdiagramofasingle-beamspectrofluorometer.FromPerkin-Elmer.

Figure8Schematicdiagram19Figure9.Schematicdiagramofaratiometricspectrofluorometer.

Figure9.Schematicdiagram20Singlephotoncountinginstrumentsareusedtomeasureverylowlightlevelsandaredesignedformaximumsignal-to-noiseperformance.

Figure10.Depictionofsinglephotoncounting.ThesignalisdetectedbythePMT,emergingasapulsewhichisthenamplified.Ifthemagnitudeoftheamplifiedpulseexceedsacertainthreshold,itispassedthroughthediscriminatorandcountedasasignal.Smallerpulsesduetonoiseanddarkcurrentaremuchmorelikelytoberejected,therebyincreasingsignal-to-noise.

Singlephotoncountinginstrum21Spectrofluorometersofferthemostflexibilityforquantitativeandqualitativeapplications.Manyinstrumentsaremodularsothatmonochromatorscanbereplacedwithfiltersintheemissionorexcitationbeamsifdesired.Spectrofluorometersofferthe22主要譜參量主要譜參量23激發(fā)譜和發(fā)射譜

熒光光譜包括激發(fā)譜和發(fā)射譜兩種。激發(fā)譜是熒光物質(zhì)在不同波長的激發(fā)光作用下測得的某一波長處的熒光強度的變化情況，也就是不同波長的激發(fā)光的相對效率；發(fā)射譜則是某一固定波長的激發(fā)光作用下熒光強度在不同波長處的分布情況，也就是熒光中不同波長的光成分的相對強度。

激發(fā)譜和發(fā)射譜24既然激發(fā)譜是表示某種熒光物質(zhì)在不同波長的激發(fā)光作用下所測得的同一波長下熒光強度的變化，而熒光的產(chǎn)生又與吸收有關(guān)，因此激發(fā)譜和吸收譜極為相似，呈正相關(guān)關(guān)系。激發(fā)譜和吸收譜的關(guān)系既然激發(fā)譜是表示某種熒光物質(zhì)在不同波長的激發(fā)光作用下所測得的25由于激發(fā)態(tài)和基態(tài)有相似的振動能級分布，而且從基態(tài)的最低振動能級躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)各振動能級的幾率與由第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級躍遷到基態(tài)各振動能級的幾率也相近，因此吸收譜與發(fā)射譜呈鏡象對稱關(guān)系。

吸收譜與發(fā)射譜的關(guān)系由于激發(fā)態(tài)和基態(tài)有相似的振動能級分布，而且從基態(tài)的最低振動能26在發(fā)射譜中最大熒光強度的位置稱為

max，它是熒光光譜的一個重要參數(shù)，對環(huán)境的極性和熒光團(tuán)的運動很敏感。

在發(fā)射譜中最大熒光強度的位置稱為max，它是熒光光譜的一個27熒光壽命(fluorescencelifetime)

去掉激發(fā)光后，分子的熒光強度降到去掉激發(fā)光時熒光強度I0的1/e所需要的時間，稱為熒光壽命，常用

表示。如熒光強度的衰減符合指數(shù)衰減的規(guī)律:It

I0e-kt其中I0是激發(fā)時最大熒光強度，It是時間t時的熒光強度，k是衰減常數(shù)。假定在時間時測得的It為I0的1/e，則是我們定義的熒光壽命。熒光壽命(fluorescencelifetime)28壽命

是衰減常數(shù)k的倒數(shù)。事實上，在瞬間激發(fā)后的某個時間，熒光強度達(dá)到最大值，然后熒光強度將按指數(shù)規(guī)律下降。從最大熒光強度值后任一強度值下降到其1/e所需的時間都應(yīng)等于。

壽命是衰減常數(shù)k的倒數(shù)。事實上，在瞬間激發(fā)后的某個時間，熒29如果激發(fā)態(tài)分子只以發(fā)射熒光的方式丟失能量，則熒光壽命與熒光發(fā)射速率的衰減常數(shù)成反比，熒光發(fā)射速率即為單位時間中發(fā)射的光子數(shù)，因此有

F

1/KF。KF是發(fā)射速率衰減常數(shù)。

F表示熒光分子的固有熒光壽命，kF表示熒光發(fā)射速率的衰減常數(shù)。如果激發(fā)態(tài)分子只以發(fā)射熒光的方式丟失能量，則熒光壽命與熒光發(fā)30處于激發(fā)態(tài)的分子，除了通過發(fā)射熒光回到基態(tài)以外，還會通過一些其它過程(如淬滅和能量轉(zhuǎn)移)回到基態(tài)，其結(jié)果是加快了激發(fā)態(tài)分子回到基態(tài)的過程(或稱退激過程)，結(jié)果是熒光壽命降低。壽命

和這些過程的速率常數(shù)有關(guān)，總的退激過程的速率常數(shù)k可以用各種退激過程的速率常數(shù)之和來表示:k

kF+kiki表示各種非輻射過程的衰減速率常數(shù)。則總的壽命

為:

1/k

1/(kF+ki)處于激發(fā)態(tài)的分子，除了通過發(fā)射熒光回到基態(tài)以外，還會通過一些31由于吸收幾率與發(fā)射幾率有關(guān)，F(xiàn)與摩爾消光系數(shù)max(單位為cm2mol-1或(moldm-3)-1cm-1)也密切相關(guān)。從下式可以得到

F的粗略估計值(單位為秒)。1/F≈104

max在討論壽命時，必須注意不要把壽命與躍遷時間混淆起來。躍遷時間是躍遷頻率的倒數(shù)，而壽命是指分子在某種特定狀態(tài)下存在的時間。通過量測壽命，可以得到有關(guān)分子結(jié)構(gòu)和動力學(xué)方面的信息。由于吸收幾率與發(fā)射幾率有關(guān)，F(xiàn)與摩爾消光系數(shù)max(32量子產(chǎn)率(quantumyield)

熒光量子產(chǎn)率是物質(zhì)熒光特性中最基本的參數(shù)之一，它表示物質(zhì)發(fā)射熒光的效率。熒光量子產(chǎn)率通常用

來表示，定義為發(fā)射量子數(shù)和吸收量子數(shù)之比，即由熒光發(fā)射造成的退激分子在全部退激分子中所占的比例，又稱為熒光效率。

發(fā)射量子數(shù)

吸收量子數(shù)

量子產(chǎn)率(quantumyield)33

的絕對值是較難用實驗的方法測量的，因為必須事先知道儀器的修正因子。實際測量中大多采用相對法，即用已知量子產(chǎn)率的標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測樣品進(jìn)行比較。后面將要證明:對稀溶液來說，熒光強度F與吸收度A成正比:FkI0A

這里k是比例常數(shù)，I0是吸收前的光強度，

是熒光量子產(chǎn)率。若兩種溶液測量條件完全相同，則它們的k和I0相同:F1/F2

A1

1/(A2

2)

1/

2

F1A2/(F2A1)已知2就可求出1。的絕對值是較難用實驗的方法測量的，因為必須事先知道儀器的修34FluorophoresarecomparedusingtheratiooftheirfluorescenceyieldsOftenfluorophoresarecomparedusingtheratiooftheirfluorescenceyields.AsweseeinFigure11.13,thisrelativefluorescenceyieldwilldependonthewavelengthchosenforobservationbecauseoftheshapesofthefluorescencespectra.Figure11.13Therelativefluorescenceyieldisdefinedforasinglewavelengthanddependsonthewavelengthchosenforobservation.Fluorophoresarecomparedusin35由于各種競爭性過程而使熒光量子產(chǎn)率減小的現(xiàn)象稱為淬滅(quenching)，如溫度淬滅、雜質(zhì)淬滅等。量子產(chǎn)率對于生色團(tuán)周圍的環(huán)境以及各種淬滅過程很敏感。量子產(chǎn)率的改變必然會引起熒光強度的改變。因此，如果只需要研究量子產(chǎn)率的相對值，則只要量測熒光強度也就足夠了。由于各種競爭性過程而使熒光量子產(chǎn)率減小的現(xiàn)象稱為淬滅(que36熒光強度熒光強度F取決于激發(fā)態(tài)的初始分布IA與量子產(chǎn)率

的乘積。這里的F指的是向各個方向上發(fā)射的熒光強度的總和，實際上，譜儀收集的只是其中的一小部分。因此儀器測到的熒光強度ＦIA

Z，這里Z是儀器因子。椐據(jù)Beer-Lambert定律可以推得：Fλ=2.3I0

(

A)C·L·

·Z式中

(

A)為激發(fā)波長A處的消光系數(shù)，Ｃ為樣品分子的濃度，I0為入射光強度，I0為透過樣品后的光強度，L為光程（樣品池光徑）熒光強度37如果激發(fā)光強保持不變，且和Z與激發(fā)波長無關(guān)，則F

(

A)很顯然，熒光強度與樣品在波度A處的消光系數(shù)有關(guān)，而消光系數(shù)與激發(fā)波長是密切相關(guān)的，消光系數(shù)隨波長的變化即吸收譜，因此熒光強度也隨激發(fā)波長的變化而變化。激發(fā)譜與吸收譜呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)然，實際上儀器因子Z與波長是有關(guān)的，這就使得激發(fā)譜與吸收譜并不完全相似。熒光光譜分析方法及原理課件38熒光偏振（偏振熒光，極化熒光）

用平面極化光（偏振光）去激發(fā)一個熒光系統(tǒng)，可以產(chǎn)生極化熒光?？梢酝ㄟ^對極化熒光的分析確定分子的大小、形狀和流動性等性質(zhì)。因此極化熒光分析在生物研究中是一種有力的手段。

熒光偏振39熒光偏振是指物質(zhì)在受激發(fā)時發(fā)射的熒光常為偏振光這樣一種性質(zhì)。溶液中分子偶極矩方向的分布是隨機的，為什么用偏振光激發(fā)時產(chǎn)生的熒光是偏振光呢？從經(jīng)典物理的觀點來看，電子的躍遷相應(yīng)于一個電偶極子的振動，其振動方向和電場變化方向一致時被激發(fā)發(fā)的幾率最大，并隨兩者間夾角余弦的平方（COS2

）而變化。電偶極子發(fā)射的熒光在與電偶極子方向垂直的方向上最強（即熒光傳播方向與電偶極子方向垂直的熒光最強），在與電偶極子平行的方向上最弱。熒光偏振是指物質(zhì)在受激發(fā)時發(fā)射的熒光常為偏振光這樣一種性質(zhì)。40溶液中的分子，其分布是隨機的，而且從吸收到發(fā)射的時間之內(nèi)，分子本身已經(jīng)產(chǎn)生了轉(zhuǎn)動，因此熒光偏振的程度將減小，所以熒光偏振又常稱為熒光消偏振或熒光去偏振。在分子朝向無規(guī)律但分子不能自由運動的溶液中，Ｐ的值稱為本征極化率P0。如果分子在激發(fā)態(tài)的壽命期間有一定的運動，則Ｐ的值可能與P0不等。溶液中的分子，其分布是隨機的，而且從吸收到發(fā)射的時間之內(nèi)，分41T-formatforpolarizationmeasurements.DET,detector;G,gain.Subscriptsrefertohorizontal(H),vertical(V),perpendicular(

)andparallel(

).

圖熒光偏振測量如圖所示，假設(shè)沿z軸振動的平面極化光由x軸入射原點，在原點有熒光分子，受其激發(fā)后此分子發(fā)射極化熒光，在y軸收集極化熒光，令I(lǐng)‖為沿ｚ軸振動的極化熒光，令I(lǐng)

為沿ｘ軸振動的極化熒光。

T-formatforpolarizationmeas42如圖所示，假設(shè)沿z軸振動的平面極化光由x軸入射原點，在原點有熒光分子，受其激發(fā)后此分子發(fā)射極化熒光，在y軸收集極化熒光，令I(lǐng)‖為沿ｚ軸振動的極化熒光，令I(lǐng)

為沿ｘ軸振動的極化熒光。定義極化率(或偏振度)P(I‖－I

)/(I‖+I

)

(IVV－IVH)/(IVV+IVH)下標(biāo)中的前、后兩個字母分別表示入射光和發(fā)射光的偏振方向，V(vertical)表示垂直，H(horizontal)表示水平，如其中IVH是指入射光偏振方向為垂直而發(fā)射光為水平時測得的熒光強度，其它如IVV也依此類推。如圖所示，假設(shè)沿z軸振動的平面極化光由x軸入射原點，在原點有43由于單色器和光電倍增管等對垂直和水平兩個偏振成分的敏感度可能不同，因而嚴(yán)格的測定需要引入校正因子G，定義G為水平偏振光激發(fā)樣品時，儀器對垂直偏振光的透射效率與對水平偏振光透射效率之比，為G

IHV/IHH

IHV為起偏器水平取向而檢偏器垂直取向時測得的熒光強度，IHH為起偏器和檢偏器均為水平取向時測得的熒光強度。儀器不同，波長不同，Ｇ值都可能不同，應(yīng)分別測定。經(jīng)校正后的熒光偏振度Ｐ(IVV

GIVH)/(IVV+GIVH)由于單色器和光電倍增管等對垂直和水平兩個偏振成分的敏感度可能44定義不對稱度(或熒光各向異性，anisotropyfactor)A

(I‖

I

)/(I‖+2I

)(I‖+2I

)表示發(fā)射光的全部，包括平行于入射光方向上的以及與入射光軸垂直的兩個方向上的分量。

經(jīng)校正后的不對稱度A(IVV

GIVH)/(IVV+2GIVH)定義不對稱度(或熒光各向異性，anisotropyfact45Additivitypropertiesofpolarization

theaverageanisotropymeasuredforamixtureofcomponentsisjustthesumoftheindividualanisotropiesweighedbytheirfluorescenceyieldF,(11.14)Additivitypropertiesofpolar46P和A的量測有時在穩(wěn)態(tài)條件下進(jìn)行，即采用恒定的光照。但有時也用毫微秒量級的偏振光脈沖來測量I‖和I

的時間函數(shù)。這種技術(shù)常能測到一些其他的運動，是一種時間分辨的技術(shù)。

P和A的量測有時在穩(wěn)態(tài)條件下進(jìn)行，即采用恒定的光照。但有時也47環(huán)境對熒光參數(shù)的影響環(huán)境對熒光參數(shù)的影響48熒光分析的主要特點是靈敏度高。一般來說，熒光分析的靈敏度要比吸收光譜測量高2－3個數(shù)量級。但正因為其靈敏度高，因此也容易受到各種因素的干擾。例如樣品的溫度度、pH值以及樣品中雜質(zhì)的存在等等。有時，為了得到可靠的結(jié)果，實驗設(shè)計和操作中需要考慮和設(shè)法減少這些因素的影響；有時，也可巧妙地利用熒光參數(shù)對環(huán)境困素的敏感性來達(dá)到我們的目的。下面，我們將分別列舉一些環(huán)境因素對max、

F和F等熒光參數(shù)的影響。熒光光譜分析方法及原理課件49SolventeffectsSolventeffectswillaffectthepositionofthefluorescenceband.Theeffectsofasolventonfluorescencecanbeverylarge,andmanystudiesofmacromoleculesusethisfact.

Generalsolventeffectsdependonthepolarizabilityofthesolvent,andincreasingthedielectricconstantusuallyshiftsthefluorescencetolongerwavelength.Specificsolventeffectsaretheresultofchemicalreactionoftheexcitedstatewiththesolvent.Importantchemicalreactionsinclude:hydrogen-bondingacid-basechemistrytheformationofcharge-transfercomplexeswhereanelectroninthefluorophoreistransferredtoanothergrouponexcitation.SolventeffectsSolventeffects50GeneralsolventeffectsGeneralsolventeffectsinvolvetheinteractionofthepermanentdipolemomentofthemoleculeinboththegroundandexcitedstateswiththereactivefieldinducedinthesurroundingsolvent.Thereactivefieldhastwoparts:theimmediatereactionoftheelectronsofthesolventmoleculestheslowerreorientationreactionofthesolventmoleculesasawholeduetotheirownpermanentdipolemoment.

GeneralsolventeffectsGeneral51溶劑影響的結(jié)果可以用Lippert方程來描述：

＋常數(shù)

其中，

a與f分別為熒光分子的吸收波數(shù)與發(fā)射波數(shù)，a

f反映了吸收光與發(fā)射光能量的差別；為溶劑的介電常數(shù)；h為普朗克常數(shù)；c為光速，a為熒光分子在溶劑中的半徑，與

分別為熒光分子處于基態(tài)和激發(fā)態(tài)時的偶極矩。溶劑影響的結(jié)果可以用Lippert方程來描述：52由上式可見，介電常數(shù)增加會使能量差增大，而折射率增加使能量差減少。由于熒光分子激發(fā)態(tài)的偶極矩

一般要大于基態(tài)偶極矩

，熒光分子偶極矩的增大與溶劑分子相互作用，使溶劑分子的電子分布和偶極子取向發(fā)生變化。溶劑偶極子的重新取向需要比電子重新分布長得多的時間。介電常數(shù)

不僅與偶極子取向有關(guān)，也與電子取向有關(guān)，上式中第一項()/(2

)是電子和偶極子重新取向的結(jié)果；折射率n與電子重新分布有關(guān)，因此上式中第二項是電子重新分布的結(jié)果。由于非極性溶劑分子沒有偶極矩，因此沒有在激發(fā)態(tài)熒光分子的作用下偶極子重新取向的問題，

n2，a

f很小。而在極性溶劑中

a

f較大，產(chǎn)生紅移。由上式可見，介電常數(shù)增加會使能量差增大，而折射率增加使能量差53SpecificsolventeffectsTheyoftenaccompanygeneralsolventeffects,becausesolventswithalargepolarizabilityareusuallycapableofhydrogenbonding.Specificsolventeffectsoccurwhenthesolventreactschemicallywiththefluorophore.Onlyasmallconcentrationofthechemicallyreactingsolventisnecessarytobringtheeffecttocompletion.Thenewspeciesoftenhasanewcharacteristicfluorescentband.SpecificsolventeffectsTheyo54Traceamountsofethanoladdedtoacyclohexanebulksolventgiverisetoanewfluorescentbandatabout400nm,whichispresumablyduetothe2-AN-ethanolhydrogen-bondedcomplex.

Thehydrogenbondingreactionof2-ANwithethanol

Thefluorescenceof2-ANisshownincyclohexanetowhichethanolwasaddedat0%(

),0.2%(...),0.4%(

),0.7%(

),l.7%(

),and2.7%(

).Traceamountsofethanoladded55環(huán)境因素對

max的影響

一般來說，處于第一電子激發(fā)態(tài)的分子，其電荷分布與它處于基態(tài)時是不同的。生色團(tuán)與周圍溶劑分子的相互作用可能會先于發(fā)射而發(fā)生，這種相互作用會改變激發(fā)態(tài)的能量及熒光發(fā)射的頻率。引起每個電子能級中最低振動能級之間的吸收和發(fā)射躍遷（即0-0躍遷）的不平衡，并會破壞鏡象關(guān)系。

環(huán)境因素對max的影響56同一種熒光物質(zhì)在不同極性的環(huán)境中，其

max可能會有所差別。一般來說，激發(fā)態(tài)的極性比基態(tài)要強，因此被激發(fā)的熒光分子將趨向于與極性溶劑（或極性環(huán)境）相互作用，使溶劑分子的電子分布會發(fā)生變化，偶極子重新取向，而這又會反過來影響熒光分子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能級，減少激發(fā)態(tài)的能量，引起發(fā)射譜的紅移。例如，當(dāng)溶劑的極性由乙二醇、甲醇、異丙醇到辛醇依次減小時，ANS（1-氨基-8-萘磺酸酯，一種熒光探針，常用于與蛋白質(zhì)非共價結(jié)合）的熒光譜發(fā)生蘭移，量子產(chǎn)率提高。

環(huán)境(如溶劑)的極性對

max的影響同一種熒光物質(zhì)在不同極性的環(huán)境中，其max可能會有所差別57

上面提到的“環(huán)境極性加強，

max紅移”的規(guī)律，并不是絕對的。例如，如果在激發(fā)態(tài)的壽命之內(nèi)，分子沒有足夠的時間來重新排列并降低激發(fā)態(tài)的能量，則可能發(fā)生max蘭移的情況。這種現(xiàn)象稱為“orientationconstraint”。因此在利用max作為環(huán)境極性的探針時要十分謹(jǐn)慎。

上面提到的“環(huán)境極性加強，max紅移”的規(guī)律，并不58pH值對

max的影響如果熒光物質(zhì)為弱酸或弱堿，則溶液pH值的改變常對max有影響。這是因為弱酸和弱堿分子和其離子在電子結(jié)構(gòu)上有所不同，因而熒光max也可能發(fā)生變化。例如，1-萘胺-5-磺酸在不同pH值時，會以兩種不同離子的形式存在，這兩種離子的熒光波長是不同的。利用這種效應(yīng)，可以將其熒光波長作為pH值的指示劑。

pH值對max的影響59溶液粘度對

max的影響溶液粘度有時也會對max有影響，例如熒光探針TNS在蔗糖水溶液中的max會隨蔗糖濃度的變化而變化。當(dāng)蔗糖濃度由10%增加到60%，粘度從1.3分泊增加到58分泊，max從580nm蘭移到555nm。

溶液粘度對max的影響60共振能量轉(zhuǎn)移對

max的影響如果兩種生色團(tuán)熒光頻率接近，則當(dāng)兩種基團(tuán)足夠接近時，用一種生色團(tuán)能吸收的光激發(fā)使之處于激發(fā)態(tài)后，處于激發(fā)態(tài)的這種生色團(tuán)可能將激發(fā)能轉(zhuǎn)移到另一種生色團(tuán)，使第二種生色團(tuán)進(jìn)入激發(fā)態(tài)，產(chǎn)生第二種生色團(tuán)特有的熒光，這種現(xiàn)象稱為共振能量轉(zhuǎn)移。顯然，共振能量轉(zhuǎn)移對max可能造成影響。

共振能量轉(zhuǎn)移對max的影響61環(huán)境對熒光量子產(chǎn)率

F和熒光強度的影響由于稀溶液中熒光強度F

KI0AF（這里I0是激發(fā)光強度，A是光密度或吸收度，

0是熒光量子產(chǎn)率，K為常數(shù)），因此凡是會影響熒光量子產(chǎn)率

F的環(huán)境因素也必然會影響熒光強度。

環(huán)境對熒光量子產(chǎn)率F和62溶劑（或環(huán)境）極性的影響量子產(chǎn)率（熒光強度）會隨著溶劑（或環(huán)境）極性的減小而增加。這一點前面已經(jīng)提到過。一種可能的機制是：在非極性的溶劑中系間交連（轉(zhuǎn)移到另外的激發(fā)態(tài)）的速率會減少。

溶劑（或環(huán)境）極性的影響63光化分解熒光物質(zhì)因吸收光能而造成某一鍵斷裂的現(xiàn)象稱為光化分解（photodissociation），光化分解會造成熒光逐漸減弱。尤其是對于稀溶液來說，光化分解就更為嚴(yán)重。

光化分解64溫度對熒光強度的影響一般來說，溶液的熒光強度隨溫度的降低而增強，溫度的升高與熒光強度的減弱在一定范圍內(nèi)是線性關(guān)系。溫度每升高1

C，熒光減弱的百分?jǐn)?shù)稱為溫度系數(shù)。一般熒光物質(zhì)的溫度系數(shù)大約為1%，但有些熒光物質(zhì)可大到5%。

溫度對熒光強度的影響65溫度升高，熒光強度減弱的原因主要是溶液的粘度減小，溶劑與溶質(zhì)分子的動能增加，使得熒光分子的其它分子之間的碰撞幾率增加，激發(fā)態(tài)熒光分子通過分子間碰撞或分子內(nèi)能量的轉(zhuǎn)移，將自己的能量轉(zhuǎn)移出去。以非熒光發(fā)射的形式回到基態(tài)，這就造成熒光淬滅、量子產(chǎn)率降低的情況。如果溶液中有淬滅劑存在，則淬滅劑的作用也會隨溫度升高而增大。為減少溫度對熒光強度的影響，可采用恒溫樣品架維持樣品溫度的恒定。

溫度升高，熒光強度減弱的原因主要是溶液的粘度減小，溶劑與溶66樣品濃度對熒光強度的影響在樣品濃度較低時，熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度成正比。但到了一定濃度以后，就不再存在這種正比關(guān)系。這是因為：

樣品濃度對熒光強度的影響67熒光強度F

K

I0(1e

lc)，這里K是儀器常數(shù)，

是量子產(chǎn)率，I0是激發(fā)光強度，

是克分子消光系數(shù)，l是樣品池光徑，C是樣品濃度。濃度增加到一定程度后，e

lc接近0，濃度繼續(xù)增加，熒光強度不再增加。只有樣品濃度很稀時，F(xiàn)KI0

[1

(1

lc)]KI0

lC

熒光強度FKI0(1el68II.熒光濃度過大時，常常發(fā)生淬滅現(xiàn)象。這樣就使熒光強度反而大大低于接近飽和時的熒光強度。對于濃度淬滅產(chǎn)生的原因最簡單的解釋是：激發(fā)態(tài)分子在發(fā)出熒光之前就和未激發(fā)的熒光物質(zhì)分子碰撞而自淬滅。

II.熒光濃度過大時，常常發(fā)生淬滅現(xiàn)象。這樣就使熒光強度反69III.濃度過高，可能形成樣品分子的二聚體或多聚體，因而降低熒光強度。

III.濃度過高，可能形成樣品分子的二聚體或多聚體，因而降70產(chǎn)生濃度淬滅的另一個重要原因之一是：當(dāng)溶液較濃時，激發(fā)光一進(jìn)入溶液，就被靠近光源一側(cè)的樣品池壁的熒光分子大量吸收，這樣，越進(jìn)入溶液，發(fā)熒光分子越少，因而大量的激發(fā)光在到達(dá)池中心之前就被吸收了。這樣，樣品池中心區(qū)域內(nèi)能被激發(fā)的熒光分子數(shù)量就很有限了。即使是樣品池中心區(qū)域內(nèi)能被激發(fā)的熒光分子，它們發(fā)出的熒光又可能被它們與檢測器之間的熒光分子吸收（如果物質(zhì)本身的吸收光譜和發(fā)射光譜有重疊的話），這樣，大部分熒光分子發(fā)射的熒光在離開吸收池前就又被吸收。

產(chǎn)生濃度淬滅的另一個重要原因之一是：當(dāng)溶液較濃時，激發(fā)光一進(jìn)71解決濃度淬滅的辦法之一，是將樣品盡量稀釋到熒光強度與熒光染料濃度成范圍線性關(guān)系的濃度來測量。濃度淬滅的現(xiàn)象有時也可以加以利用，例如在脂質(zhì)體里包裹高濃度的熒光染料，由于濃度淬滅，包裹在脂質(zhì)體內(nèi)的熒光染料熒光強度很低。一旦熒光染料從脂質(zhì)體內(nèi)泄漏出來，由于熒光染料濃度下降，進(jìn)入線性區(qū)，因此熒光強度大大增加。

解決濃度淬滅的辦法之一，是將樣品盡量稀釋到熒光強度與熒光染料72雜質(zhì)對量子產(chǎn)率（熒光強度）的影響除熒光分子之外的其它分子與熒光分子的相互作用使熒光量子產(chǎn)率減少的現(xiàn)象統(tǒng)稱為雜質(zhì)淬滅。會引起熒光淬來的物質(zhì)稱為淬滅劑。例如中性的0.1M磷酸緩沖液能淬滅酪氨酸的熒光。

雜質(zhì)對量子產(chǎn)率73雜質(zhì)淬滅的幾種形式Ⅰ.碰撞淬滅：溶液中熒光分子與淬滅劑分子碰撞，熒光分子損失能量而導(dǎo)致量子產(chǎn)率減少，熒光強度降低。Ⅱ.組成化合物導(dǎo)致熒光淬滅：一部分熒光分子與淬滅劑分子作用而形成絡(luò)合物。這種絡(luò)合物本身可能不發(fā)熒光，也可能會具有吸收激發(fā)光能或熒光物質(zhì)所發(fā)射的熒光光能的能力，從而減少觀察到的熒光（內(nèi)濾光效應(yīng)）。

雜質(zhì)淬滅的幾種形式74Ⅲ.含溴、含碘化合物、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物及某些雜環(huán)化合物容易由單線態(tài)轉(zhuǎn)變至三線態(tài)。轉(zhuǎn)入三線態(tài)的分子在常溫下不發(fā)光，它們把多余的能量消耗在與其它分子的碰撞中，引起熒光淬滅。只有在低溫下，由三線態(tài)返回基態(tài)而放出波長的磷光。

Ⅲ.含溴、含碘化合物、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物、75Ⅳ.發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的淬滅。某些淬滅劑分子與熒光物質(zhì)分子相互作用時會發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即氧化

還原反應(yīng)，從而引起熒光淬滅。甲基蘭熒光溶液被Fe

2淬滅就是一個例子。發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的淬滅劑并不限于金屬離子。I

、Br

等易于給出電子的陰離子對奎寧、羅丹明及熒光素鈉等有機熒光物質(zhì)也會發(fā)生淬滅作用。

Ⅳ.發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的淬滅。76引起淬滅的一種最常見的物質(zhì)是處于三線態(tài)的活性氧。產(chǎn)生淬滅的原因主要是由于處于三線態(tài)的活性氧分子與單線態(tài)的熒光分子相互作用時會形成單線態(tài)的氧分子和三線態(tài)的熒光分子。氧在弱極性溶劑中的溶解度比較高，例如氧在乙烷中的溶解度約為在水中的幾倍。因此必須通氮趕氧，克服這種淬滅。

引起淬滅的一種最常見的物質(zhì)是處于三線態(tài)的活性氧。產(chǎn)生淬滅的原77Ⅴ.共振能量轉(zhuǎn)移：（略）

Ⅴ.共振能量轉(zhuǎn)移：（略）78總的來說，為克服雜質(zhì)淬滅帶來的問題，對所使用的溶劑或緩沖液，首先要考慮其對所使用的熒光物質(zhì)是否有直接作用。另外必須考慮溶劑的純度。如洗液中的重鉻酸鉀，其兩個吸收峰恰好在色氨酸的激發(fā)和發(fā)射峰附近，會吸收色氨酸的激發(fā)能及其發(fā)射的熒光（內(nèi)濾光效應(yīng)）因此熒光器皿不能用洗液來洗。

總的來說，為克服雜質(zhì)淬滅帶來的問題，對所使用的溶劑或緩沖液，79pH值對量子產(chǎn)率和熒光強度的影響如熒光物質(zhì)為弱酸或弱堿，則溶液pH值的改變常對熒光強度有較大影響。利用這些物質(zhì)對pH值的敏感性，可以將它們用作pH指示劑，或利用它們在不同pH值溶液中熒光強度的改變來判斷酸堿滴定的終點（特別是在有色或混濁的溶液中）。pH值對量子產(chǎn)率和熒光強度的影響的另一個例子是，pH10.9時，色氨酸量子產(chǎn)率最高，為0.51；pH在4－8之間，量子產(chǎn)率為0.2；pH小于4時，量子產(chǎn)率只有0.085。pH值對量子產(chǎn)率和熒光強度的影響80溶液粘度對熒光強度的影響熒光強度一般隨介質(zhì)粘度的升高而增強。因為介質(zhì)粘度增加，減少了分子碰撞，從而減少了能量損失。例如熒光物質(zhì)TNS在不同濃度的蔗糖水溶液中，熒光強度隨粘度增加而增加。

溶液粘度對熒光強度的影響81熒光光譜分析方法及原理課件82其它各種干擾因素一些其它的干擾因素可能影響熒光強度：光散射可能影響熒光強度。區(qū)分散射光和熒光發(fā)射的依據(jù)，是散射光與激發(fā)光波長相同，離熒光峰較遠(yuǎn)；熒光污染也是影響熒光強度的一種因素：洗滌器皿的合成去污劑常能產(chǎn)生很強的熒光；分液偏斗上涂的潤滑油也有很強的熒光；溶液中微生物的產(chǎn)生；濾紙中的雜質(zhì)；表面吸咐也會對稀溶液的熒光測定造成影響。

其它各種干擾因素83環(huán)境因素對熒光壽命的影響環(huán)境因素對熒光壽命的影響84碰撞淬滅前面曾提到碰撞淬滅會降低熒光強度，碰撞淬滅也可能使熒光壽命縮短。例如前面提到的0.1M磷酸緩沖液，能使酪氨酸的熒光壽命從3.4ns縮短到2.6ns。

碰撞淬滅85濃度與熒光壽命的關(guān)系熒光生色團(tuán)的濃度增加，熒光量子產(chǎn)率下降，但熒光壽命不一定減少，一些熒光染料的熒光壽命反而隨濃度的增加而延長。這種現(xiàn)象不是由于二聚體的形成，而是由于自吸收。特別是當(dāng)吸收光譜與熒光光譜有較大重疊時，重疊區(qū)的熒光發(fā)射后，再一次被吸收，經(jīng)歷了二次激發(fā)或多次激發(fā)，測量到的表觀壽命就會延長。

濃度與熒光壽命的關(guān)系86分子內(nèi)環(huán)境與熒光壽命生色團(tuán)在分子內(nèi)的環(huán)境也會影響熒光壽命，正是由于這個原因，熒光壽命才被用來分析分子內(nèi)不同的生色團(tuán)所處的環(huán)境。當(dāng)然，嚴(yán)格地說，分子內(nèi)環(huán)境和外環(huán)境是兩個不同的概念。分子內(nèi)環(huán)境與熒光壽命87除上述可能影響熒光壽命的因素之外，實際中要注意的是，不同測量方法測出的壽命也會有一定差別。因此研究熒光壽命時，相同方法和相同條件測量出來的壽命才有可比性除上述可能影響熒光壽命的因素之外，實際中要注意的是，不同測量88環(huán)境對熒光偏振度的影響

溫度對熒光偏振度P的影響溫度對熒光偏振度P的影響：一般來說，溫度升高，熒光偏振度會下降。

粘度對熒光偏振度的影響隨著粘度的提高，熒光偏振度也會上升。

環(huán)境對熒光偏振度的影響89熒光光譜在生物學(xué)中的應(yīng)用熒光光譜在生物學(xué)中的應(yīng)用90天然熒光生色團(tuán)和熒光探針(Naturalfluorophoresandfluorescentprobes)天然熒光生色團(tuán)和熒光探針(Naturalfluoropho91Fluorescentmoleculesareoftenreferredtoasfluorophores.Fluorescentmoleculesareofte92判斷熒光生色團(tuán)的標(biāo)準(zhǔn)判斷化合物能否產(chǎn)生熒光，可以從以下幾個方面來分析：碳原子骨架：具有共軛雙鍵體系的分子容易產(chǎn)生熒光。絕大多數(shù)熒光物質(zhì)含有芳香環(huán)或雜環(huán)。任何有利于

電子共軛度的結(jié)構(gòu)變化都將提高熒光效率。分子的幾何排布：具有剛性平面結(jié)構(gòu)的有機分子容易發(fā)熒光。平面構(gòu)型或分子剛性增加，熒光增強。取代基的類型和位置。環(huán)境、溶劑、溫度、pH等均會影響分子結(jié)構(gòu)，從而影響熒光。判斷熒光生色團(tuán)的標(biāo)準(zhǔn)判斷化合物能否產(chǎn)生熒光，可以從以下幾93生物化學(xué)中主要的熒光生色團(tuán)生物化學(xué)中主要的熒光生色團(tuán)可分為兩類:天然熒光生色團(tuán)熒光指示劑（熒光探針）生物化學(xué)中主要的熒光生色團(tuán)生物化學(xué)中主要的熒光生色團(tuán)可分為兩94主要的天然熒光生色團(tuán)蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸核黃素、維生素A、葉綠素等天然色素和NADH等少數(shù)分子核酸中tRNA中的Y堿基（二氫尿嘧啶）主要的天然熒光生色團(tuán)蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸95蛋白質(zhì)和核酸中的熒光生色團(tuán)蛋白質(zhì)和核酸中的熒光生色團(tuán)96在蛋白質(zhì)的熒光譜中，由色氨酸殘基發(fā)出的熒光占統(tǒng)治地位。這一方面是由于色氨酸的吸收度和量子產(chǎn)率較高，另一方面是由于在色氨酸存在的條件下，酪氨酸吸收的能量常常不是自己通過熒光發(fā)射釋放出來，而是傳遞給色氨酸，由色氨酸發(fā)出熒光。在蛋白質(zhì)的熒光譜中，由色氨酸殘基發(fā)出的熒光占統(tǒng)治地位。這一方97熒光探針總的來說，天然的熒光生物分子種類很有限，而且熒光強度較弱，為了研究多數(shù)的不發(fā)光的生物分子，人們廣泛利用一類能產(chǎn)生穩(wěn)定熒光的分子，把這些小分子和大分子結(jié)合起來，或者插入大分子中，根據(jù)這些較小的熒光分子性質(zhì)的改變，分析大分子的結(jié)構(gòu)，這類小分子稱為熒光探針。熒光探針總的來說，天然的熒光生物分子種類很有限，而且熒光強度98對于作為熒光探針的分子有以下幾個基本要求：能產(chǎn)生穩(wěn)定的，較強的熒光。探針與被研究分子的某一微區(qū)必須有特異性的結(jié)合，而且結(jié)合得比較牢固。探針的熒光必須對環(huán)境條件較敏感。結(jié)合的探針不應(yīng)影響被研究的大分子的結(jié)構(gòu)和特性。對于作為熒光探針的分子有以下幾個基本要求：99TypicalfluorescentprobesTypicalfluorescentprobes100Structuresof

somefluorescentprobesStructuresof

somefluorescen101參考文獻(xiàn)ALANWAGGONER,CovalentLabelingofProteinsandNucleicAcidswithFluorophores,inMETHODSINENZYMOLOGY.VOL246,p362-373參考文獻(xiàn)ALANWAGGONER,CovalentLa102天然色素的內(nèi)源熒光分析

維生素大多含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，本身具有較強的天然熒光，因此可以利用內(nèi)源熒光檢測維生素。例如，可用345nm激發(fā)，490nm處測量，用以確定血液中維生素A的含量。核黃素即維生素B2在pH7.0時，用激發(fā)波長370nm（或440nm），發(fā)射波長為565nm檢測，可以確定組織中核黃素的總量。維生素B12在pH7的溶液中，可以用275nm激發(fā)，305nm處檢測。維生素C用490nm激發(fā)，可產(chǎn)生綠色熒光（530nm）。天然色素的內(nèi)源熒光分析維生素大多含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，本103植物、藻類或光合細(xì)菌中含有各種色素和輔助色素分子，包括葉綠素a、b、c1、c2，類胡蘿卜素如

-胡蘿卜素、巖藻黃質(zhì)、多甲藻黃素，藻膽素如藻藍(lán)素、藻紅素等，都含有熒光生色團(tuán)，它們的熒光激發(fā)譜和熒光發(fā)射譜都可用來鑒定色素的存在及含量，也可以用來分析光合作用過程中能量的吸收與傳遞。植物、藻類或光合細(xì)菌中含有各種色素和輔助色素分子，包括葉綠素104熒光光譜分析方法及原理課件105用熒光光譜測量光合效率用熒光光譜測量光合效率106光合系統(tǒng)中色素內(nèi)源熒光是研究光合作用的一個非常重要的信息來源，熒光光譜儀因而也就成了植物生理學(xué)家的“聽診器”，一些專用的熒光儀可以方便地攜帶到田間直接測量作物葉片的光合效率。光合系統(tǒng)中的天線色素如葉綠素吸收太陽光的光能后被激發(fā)到能量較高的激發(fā)態(tài)，然后會以各種形式耗散其吸收的能量，弛豫回到基態(tài)。這些能量耗散的形式包括將能量傳遞到光合反應(yīng)中心，進(jìn)而進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)，也包括熒光發(fā)射。如果反應(yīng)中心的光化學(xué)反應(yīng)由于某種原因受阻，則熒光產(chǎn)率會增高。換句話說，熒光越強，光化學(xué)速率越低，熒光越弱，光合效率越高。因此，可以利用熒光強度的變化估算出光合效率的高低。光合系統(tǒng)中色素內(nèi)源熒光是研究光合作用的一個非常重要的信息來源107熒光光譜分析方法及原理課件108ApplicationsofFluorescentProbesNucleicAcidDetectionPeptideandProteinDetection,AnalysisandSynthesisEnzymesandEnzymeSubstratesProbesforActin,TubulinandNucleotide-BindingProteinsProbesforOrganellesProbesforLipidsandMembranesFluorescentTracersofCellMorphologyandFluidFlowAssaysforCellViability,ProliferationandFunctionProbesforEndocytosis,ReceptorsandIonChannelsPhotoactivatable(Caged)ProbesProbesforSignalTransductionProbesforReactiveOxygenSpecies,IncludingNitricOxideIndicatorsforCa(2+),Mg(2+),Zn(2+)andOtherMetalspHIndicatorsIndicatorsforNa(+),K(+),Cl(-)andOtherAnionsProbesforMembranePotentialApplicationsofFluorescentPr109FLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTElNSFluorescencehasprovedtobeaparticularlyvaluabletechniqueforstudyingproteins.Usethefluorescenceofproteinstoillustrate:analyticaldetectionchangesinquantumyieldtheeffectsofenergytransferchangesinfluorescencepolarizationwithtimethatcanbeusedtomonitorshapestudythestoichiometryofcomplexformationobservethepresenceofintermediatesdetermineequilibriumconstantsascertainthemicroenvironmentofbindingsites.

FLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTEl110FLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTElNS1.AnalyticaldetectionFLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTEl111ANALYTlCALAPPLlCATIONS

FluorescenceintensityFisusefultobiochemistsinobservingthepresenceofamacromolecule.

ANALYTlCALAPPLlCATIONSFluo112Forinstance,biopolymersemergingfromahighpressureliquidchromatograph(HPLC)mightbemonitoredwithafluorescencedetector.WeseeinFigure11.6atheresultsfortheisolationoftheproteinmelittinfromhoneybeevenomonanHPLC.Melittinhasatryptophanresiduethatcanbeexcitedat280nmtofluoresceoverarangeofwavelengthsthatinclude340nm.TwoproteinsareelutedfromtheHPLCthathave340nmfluorescence,oneat5.9minandoneat11.7min.Thefractionat11.7minhasmelittinactivity(hemolysisofredbloodcells).MonitoringtheelutionwithnormalUVabsorbanceat214nm(Figure11.6b)revealsanumberofotherfractionsthatcontainbiologicalmolecules,butthesedonothavetobeconsideredbecausetheydonotfluoresce.Byusingfluorescenceforanalysis,identificationoftheproperfractionissimplified.

Figure11.6Thefluorescence(a)andelectronicabsorption(b)foramelittinpreparationemergingfromahighpressureliquidchromatograph.Themelittinelutesat11.7min.Forinstance,biopolymersemer113FLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTElNS2.ChangesinquantumyieldFLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTEl114QuantumyieldisausefulquantityQuantumyieldisausefulquantityChangesinthequantumyieldareoftendiagnosticofchangesinthemolecularenvironmentofachromophoreForexample,thequantumyieldofafluorophorewilloftenincreasewhenthemoleculeistakenupfromsolutionandboundtoamacromoleculesuchasDNAoraprotein.Measurementofthequantumyieldprovidesasimplewaytomeasurebinding.Quantumyieldisausefulquan115利用蛋白質(zhì)的天然熒光檢測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化氨基?；冈谑榛蛩徜囎饔孟聝?nèi)源熒光發(fā)射譜隨作用時間的變化,隨作用時間的增加，熒光強度逐漸減小。表明隨作用時間的增加，該蛋白質(zhì)逐漸變性，發(fā)生去折疊，蛋白質(zhì)內(nèi)部的熒光生色團(tuán)逐漸暴露在極性水環(huán)境中。Changesinthefluorescenceemissionspectraofaminoacylaseduringdenaturationin0.6mMLDS.Repeatedscanofthefluorescenceemissionspectrawithanexcitationwavelengthof295nmaftermixingtheenzymewithLDSsolution.Thefinalconcentrationoftheenzymewas0.37

M.Reactiontimesoftheenzymedenaturaionforcurvesfromtoptobottomwere0,1,3,5,8,10,15,20,25,30,40and50min,respectively.利用蛋白質(zhì)的天然熒光檢測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化氨基酰化酶在十二116FLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTElNS3.TheeffectsofenergytransferFLUORESCENCEAPPLlEDTOPROTEl117共振能量轉(zhuǎn)移參考文獻(xiàn)1.PAULR.SELVIN,FluorescenceResonanceEnergyTransfer,in“METHODSINENZYMOLOGY.”VOL246,p300-3342,3,4見所提供的閱讀文獻(xiàn)共振能量轉(zhuǎn)移參考文獻(xiàn)118Energytransfer

Underfavorablecircumstancesexcitationenergycanbetransferredfromonefluorophoretoanother:TransitiondipoleinteractionbetweenthetwofluorophoresAnappreciableoverlapofthefluorescencespectrumofthedonorwiththeabsorptionspectrumoftheacceptorTherequirementofdipole-dipoleinteractionbetweenthefluorophoresleadstoastrongdependenceofenergytransferonthedistancebetweentheparticipatinggroups

EnergytransferUnderfavora119如果兩種不同的熒光生色團(tuán)離得較近，且其中一種生色團(tuán)的熒光發(fā)射譜與另一種生色團(tuán)的激發(fā)譜有相當(dāng)程度的重疊。則當(dāng)?shù)谝环N熒光團(tuán)被激發(fā)時，另一種熒光團(tuán)卻因第一種生色團(tuán)激發(fā)能的轉(zhuǎn)移而被激發(fā)，這種現(xiàn)象稱為共振能量轉(zhuǎn)移。

共振能量轉(zhuǎn)移如果兩種不同的熒光生色團(tuán)離得較近，且其中一種生色團(tuán)的熒光發(fā)射120DependenceofefficiencyofenergytransferonthesixthpoweroftheseparationrFigure11.14Theefficiencyofenergytransferchangesrapidlywiththedistancebetweendonorandacceptor.Dependenceofefficiencyofen121EfficiencyofenergytransferTheefficiencyoftransferisgivenbyefficiency=HereR0isthedistancefor0.5efficiencyoftransfer,andischaracteristicofthedonor-acceptorpairandthemediumbetweenthem.EfficiencyofenergytransferT122R0稱為臨界距離，定義為能量轉(zhuǎn)移效率為50%時兩個生色團(tuán)之間的距離，對于每個供體一受體時，R0是常數(shù)。R0可以根據(jù)受體的吸收譜和供體的發(fā)射譜、介質(zhì)的折射系數(shù)、供體和受體躍遷電偶極矩的朝向因子、供體在沒有受體存在時的量子產(chǎn)率等參數(shù)估算出來。根據(jù)轉(zhuǎn)移效率和R0，即可求出兩個生色團(tuán)之間的距離。這種測定生色團(tuán)距離的方法，常被人稱為光譜尺。R0稱為臨界距離，定義為能量轉(zhuǎn)移效率為50%時兩個生色團(tuán)123R0FOR