測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量

【目的要求】學(xué)習(xí)SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理。掌握垂直板電泳的操作方法。運(yùn)用SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定?！緦?shí)驗(yàn)原理】電泳帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。PAGE

聚丙烯酰胺凝膠（PAG）是由單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在加速劑四甲基乙二胺(TEMED)和引發(fā)劑過硫酸銨(AP)的作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。以此凝膠作為支持介質(zhì)的電泳稱為PAGE。PAGE具有電泳和分子篩的雙重作用。CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N,

N’-甲叉雙丙烯酰胺CH2=CHC=O

NH

CH2

NHC=O

CH2=CH聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CHC=ONHCH2NHC=O

CH2-CHCH2ˉ

CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()m

PAG機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，改變

Acr濃度或Acr與Bis的比例可以得到不同孔徑的凝膠。PAGE分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值與凝膠中的相同.帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。SDS

是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS和含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS是一種很強(qiáng)的陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。【SDS基本原理】

強(qiáng)還原劑巰基乙醇可以斷開二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS

復(fù)合物。

蛋白質(zhì)分子結(jié)合SDS陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基的相對(duì)分子質(zhì)量。而與其所帶電荷的性質(zhì)無關(guān)。

有許多蛋白質(zhì)是由亞基或兩條以上肽鏈組成的，它們?cè)?/p>

SDS和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質(zhì)，測(cè)定的只是亞基或單條肽鏈的MW。將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在SDS

中的電泳遷移率對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，即可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。只要測(cè)得未知分子量的蛋白質(zhì)在相同條件下的電泳遷移率，就能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其分子量。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在17,000～165,000之間時(shí)，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的電泳遷移率與蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系：

lgMW=K-bm

【操作方法】１、垂直板電泳槽

1）分離膠的制備

配制12%分離膠。在燒杯中依次加入重蒸水3.35ml,分離膠緩沖液2.5ml,10%SDS0.1ml,凝膠儲(chǔ)備液4.0ml，10%過硫酸銨50ul和TEMED10ul（兩塊膠的量？？？）。由于AP和TEMED相遇后凝膠即開始聚合，所以應(yīng)立即混勻混合液，用移液槍抽取3.2~3.5ml凝膠液加至長(zhǎng)、短玻璃板間的窄縫內(nèi).再用注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水,用于隔絕空氣，使膠面平整。37℃烘箱下聚合（約30-60min）。待凝膠完全聚合.將貯槽的蒸餾水倒去，用細(xì)條濾紙吸去殘留的水液。2、凝膠的制備2）濃縮膠的制備配制3%濃縮膠。在燒杯中依次加入重蒸水3.12ml,濃縮膠緩沖液1.25ml,10%SDS0.05ml,凝膠儲(chǔ)備液0.6ml，10%過硫酸銨25ul和TEMED5ul（兩塊膠的量？？？）?；靹蚝笥米⑸淦骷拥揭丫酆系姆蛛x膠上方，直至距離短玻璃板上緣約0.5cm處(立即清洗注射器及針頭)。輕輕插入梳齒至濃縮膠內(nèi)，避免帶入氣泡。約30min后凝膠聚合。2、凝膠的制備3、蛋白質(zhì)樣品的處理1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品的處理低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒:兔磷酸化酶B

MW=97,400

牛血清白蛋白MW=66,200

牛碳酸酐酶MW=31,000

胰蛋白酶抑制劑MW=20,100

雞蛋清溶菌酶MW=14,400

開封后，沸水浴中加熱3-5min后上樣。2）樣液的準(zhǔn)備

用移液槍小心吸取處理好的血清50ul至1.5ml的離心管中，再加入50ul上樣緩沖液，混勻后沸水浴中加熱3min，取出冷卻后加樣。StakinggelSeparatinggel

將電泳儀的正負(fù)極與電泳槽正負(fù)極相連接，打開電泳儀開關(guān)，設(shè)置電壓為110V，電泳80mins,此時(shí)溴酚藍(lán)染料達(dá)到凝膠底部，停止電泳，關(guān)閉電源。5、電泳4、加樣

用移液器分別取10

l樣品液，小心將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。7、結(jié)果處理

量出加樣端距細(xì)銅絲間的距離(cm)以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離(cm)，按下式計(jì)算相對(duì)遷移率mR：

相對(duì)遷移率mR=

蛋白質(zhì)樣品遷移距離(cm)溴酚藍(lán)區(qū)帶距加樣端距離(cm)6

、染色與脫色

電泳結(jié)束后，取下玻板，在自來水下用特制板撬開短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標(biāo)記，在兩側(cè)溴酚藍(lán)染料區(qū)帶中心，插入細(xì)銅絲作為前沿標(biāo)記。加入染色液染色