酶促法合成維生素e琥珀酸酯

酶促法合成維生素e琥珀酸酯

維生素e酯類維生素e，也被稱為發(fā)芽酚，包括四種類型：-質子、-質子、-質子和-質子。維生素E是人類生命活動中不可缺少的維生素,也是一種重要的抗氧化劑,廣泛應用于醫(yī)藥、食品添加劑、化妝品等多個領域。但是維生素E性質很不穩(wěn)定,易被空氣氧化失去生物活性,這給維生素E產品的制備、貯存等帶來許多不便目前維生素E酯主要由化學法合成。一般使用三乙胺、吡啶或酸堿作催化劑,環(huán)境污染大,反應溫度較高與化學合成法相比,酶法合成具有反應條件溫和、催化效率高、催化專一性強等優(yōu)點。Torres等1材料和方法1.1素e表現為維生素E琥珀酸酯(α-生育酚琥珀酸單酯,文中統(tǒng)稱維生素E琥珀酸酯),純度99.9%,購于sigma公司。維生素E(α-生育酚),純度97%,購于AlfaAesar公司。Novozym435(樹脂固定化1.2學生犯罪率測定高效液相色譜儀,日本島津公司LC-20A(配SPD-M20A二極管陣列檢測器)。三用紫外分析儀(WFH-203),上海精科實業(yè)有限公司。1.3脂肪酶法合成維生素e往50ml具塞錐形瓶中加入5ml叔丁醇和DMSO混合溶劑,適量的維生素E和琥珀酸酐,待兩底物完全溶解后,加入適量脂肪酶,蓋好瓶塞,置于轉速為200r·min1.4品質測定采用橄欖油乳化液水解滴定法測定1.5修飾液的配制稱取修飾劑琥珀酸酐溶于二甲基亞砜中,配制成一定濃度的修飾液。將已知質量的Novozym435浸泡于pH8.0的磷酸緩沖液(0.02mol·L1.6檢測條件確定維生素E琥珀酸酯定性分析采用薄層分析與HPLC相結合;定量分析為HPLC法。薄層分析法:自制硅膠板(GF254),展開劑為正己烷∶乙酸乙酯∶冰醋酸(體積比)=8∶1.5∶0.5,采用色譜純甲醇配制維生素E標準品、維生素E琥珀酸酯標準品、反應物樣品,分別在硅膠板上點樣,待各樣充分展開后,取出層析板,晾干。在254nm紫外燈下觀察實驗結果。發(fā)現反應物樣品與維生素E琥珀酸酯標準品在同一位置出點,并且未見其他雜點,判斷反應物中有維生素E琥珀酸酯的生成。HPLC分析條件:配制維生素E和維生素E琥珀酸酯的甲醇溶液,進行全波長掃描,確定各自的最大吸收波長(分別為292nm和285nm)。色譜柱為AkasilC2結果與討論2.1根霉脂肪酶分別以根霉脂肪酶(2.2e表現為表面活性劑有機介質性質是有機相酶促反應的重要因素,有機溶劑可奪走吸附在酶分子表面的必需水,破壞酶的活性構象,而且影響反應體系中傳質速率維生素E琥珀酸酯在DMSO中有較高的產率,但極性很強的DMSO容易奪取酶分子表面的水并爭奪蛋白質結構內部的氫鍵,導致蛋白質變性,使其催化活性降低2.3羧酸衍生物常用的?；w有羧酸、羧酸酯(包括羧酸乙烯酯和羧酸烷基酯)以及其他一些羧酸衍生物等。文獻報道乙烯酯作為?；w比烷基酯發(fā)生酯交換反應速度高20～100倍,因為乙烯酯作為酰基供體反應過程中生成的是乙烯醇,會異構為低沸點的乙醛而極易除去,從而促使平衡向酯生成的方向移動2.4反應溫度對反應的影響溫度是影響酶催化作用的主要因素之一。一方面,隨著溫度的升高,反應速度加快;另一方面,酶是生物大分子,過高的溫度會引起酶的變性失活。而且本反應中底物維生素E化學性質極不穩(wěn)定,過高的反應溫度會導致其降解變性,影響最終反應產率。將0.43g維生素E和0.60g琥珀酸酐(即摩爾比改為1∶6)溶于5mlDMSO與叔丁醇混合溶劑(兩者體積比為3∶2)中,加入0.02g假絲酵母脂肪酶(隨著反應溫度的升高,反應速度逐漸加快,最終的維生素E琥珀酸酯產率升高。但反應溫度超過30℃后,隨溫度的升高,反應最終產率相差不大。而且實驗證實,溫度超過40℃維生素E有明顯的降解變性發(fā)生;高溫反應可能造成維生素E琥珀酸酯顏色深,品質差2.5響應面實驗設計響應面分析(responsesurfacemethodology,RSM)是數學和統(tǒng)計學相結合的產物,采用多元二次回歸方法作為函數估計的工具,用于酶促反應實驗的設計與分析,具有實驗周期短、求得的回歸方程精度高、能快速有效得到反應最優(yōu)條件等優(yōu)點。根據單因素實驗結果,在固定其他反應條件的前提下[反應溫度30℃,反應介質為5mlDMSO與叔丁醇混合溶劑(體積比為3∶2),催化劑為0.02g假絲酵母脂肪酶],選定底物摩爾比、底物濃度(以維生素E濃度為準,琥珀酸酐按照摩爾比加入)、反應時間這3個因素作為自變量,以維生素E琥珀酸酯產率為響應值進行響應面實驗分析,各因素的水平設計見表3。采用Mintab15軟件選用Box-Behnken進行實驗設計并以隨機順序進行實驗,各實驗點設