酶促法合成維生素e琥珀酸酯

酶促法合成維生素e琥珀酸酯

維生素e酯類維生素e，也被稱為發(fā)芽酚，包括四種類型：-質(zhì)子、-質(zhì)子、-質(zhì)子和-質(zhì)子。維生素E是人類生命活動(dòng)中不可缺少的維生素,也是一種重要的抗氧化劑,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品添加劑、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域。但是維生素E性質(zhì)很不穩(wěn)定,易被空氣氧化失去生物活性,這給維生素E產(chǎn)品的制備、貯存等帶來許多不便目前維生素E酯主要由化學(xué)法合成。一般使用三乙胺、吡啶或酸堿作催化劑,環(huán)境污染大,反應(yīng)溫度較高與化學(xué)合成法相比,酶法合成具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高、催化專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。Torres等1材料和方法1.1素e表現(xiàn)為維生素E琥珀酸酯(α-生育酚琥珀酸單酯,文中統(tǒng)稱維生素E琥珀酸酯),純度99.9%,購(gòu)于sigma公司。維生素E(α-生育酚),純度97%,購(gòu)于AlfaAesar公司。Novozym435(樹脂固定化1.2學(xué)生犯罪率測(cè)定高效液相色譜儀,日本島津公司LC-20A(配SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器)。三用紫外分析儀(WFH-203),上海精科實(shí)業(yè)有限公司。1.3脂肪酶法合成維生素e往50ml具塞錐形瓶中加入5ml叔丁醇和DMSO混合溶劑,適量的維生素E和琥珀酸酐,待兩底物完全溶解后,加入適量脂肪酶,蓋好瓶塞,置于轉(zhuǎn)速為200r·min1.4品質(zhì)測(cè)定采用橄欖油乳化液水解滴定法測(cè)定1.5修飾液的配制稱取修飾劑琥珀酸酐溶于二甲基亞砜中,配制成一定濃度的修飾液。將已知質(zhì)量的Novozym435浸泡于pH8.0的磷酸緩沖液(0.02mol·L1.6檢測(cè)條件確定維生素E琥珀酸酯定性分析采用薄層分析與HPLC相結(jié)合;定量分析為HPLC法。薄層分析法:自制硅膠板(GF254),展開劑為正己烷∶乙酸乙酯∶冰醋酸(體積比)=8∶1.5∶0.5,采用色譜純甲醇配制維生素E標(biāo)準(zhǔn)品、維生素E琥珀酸酯標(biāo)準(zhǔn)品、反應(yīng)物樣品,分別在硅膠板上點(diǎn)樣,待各樣充分展開后,取出層析板,晾干。在254nm紫外燈下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。發(fā)現(xiàn)反應(yīng)物樣品與維生素E琥珀酸酯標(biāo)準(zhǔn)品在同一位置出點(diǎn),并且未見其他雜點(diǎn),判斷反應(yīng)物中有維生素E琥珀酸酯的生成。HPLC分析條件:配制維生素E和維生素E琥珀酸酯的甲醇溶液,進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,確定各自的最大吸收波長(zhǎng)(分別為292nm和285nm)。色譜柱為AkasilC2結(jié)果與討論2.1根霉脂肪酶分別以根霉脂肪酶(2.2e表現(xiàn)為表面活性劑有機(jī)介質(zhì)性質(zhì)是有機(jī)相酶促反應(yīng)的重要因素,有機(jī)溶劑可奪走吸附在酶分子表面的必需水,破壞酶的活性構(gòu)象,而且影響反應(yīng)體系中傳質(zhì)速率維生素E琥珀酸酯在DMSO中有較高的產(chǎn)率,但極性很強(qiáng)的DMSO容易奪取酶分子表面的水并爭(zhēng)奪蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部的氫鍵,導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,使其催化活性降低2.3羧酸衍生物常用的酰基供體有羧酸、羧酸酯(包括羧酸乙烯酯和羧酸烷基酯)以及其他一些羧酸衍生物等。文獻(xiàn)報(bào)道乙烯酯作為?；w比烷基酯發(fā)生酯交換反應(yīng)速度高20～100倍,因?yàn)橐蚁プ鳛轷；w反應(yīng)過程中生成的是乙烯醇,會(huì)異構(gòu)為低沸點(diǎn)的乙醛而極易除去,從而促使平衡向酯生成的方向移動(dòng)2.4反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)的影響溫度是影響酶催化作用的主要因素之一。一方面,隨著溫度的升高,反應(yīng)速度加快;另一方面,酶是生物大分子,過高的溫度會(huì)引起酶的變性失活。而且本反應(yīng)中底物維生素E化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定,過高的反應(yīng)溫度會(huì)導(dǎo)致其降解變性,影響最終反應(yīng)產(chǎn)率。將0.43g維生素E和0.60g琥珀酸酐(即摩爾比改為1∶6)溶于5mlDMSO與叔丁醇混合溶劑(兩者體積比為3∶2)中,加入0.02g假絲酵母脂肪酶(隨著反應(yīng)溫度的升高,反應(yīng)速度逐漸加快,最終的維生素E琥珀酸酯產(chǎn)率升高。但反應(yīng)溫度超過30℃后,隨溫度的升高,反應(yīng)最終產(chǎn)率相差不大。而且實(shí)驗(yàn)證實(shí),溫度超過40℃維生素E有明顯的降解變性發(fā)生;高溫反應(yīng)可能造成維生素E琥珀酸酯顏色深,品質(zhì)差2.5響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析(responsesurfacemethodology,RSM)是數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物,采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計(jì)的工具,用于酶促反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與分析,具有實(shí)驗(yàn)周期短、求得的回歸方程精度高、能快速有效得到反應(yīng)最優(yōu)條件等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在固定其他反應(yīng)條件的前提下[反應(yīng)溫度30℃,反應(yīng)介質(zhì)為5mlDMSO與叔丁醇混合溶劑(體積比為3∶2),催化劑為0.02g假絲酵母脂肪酶],選定底物摩爾比、底物濃度(以維生素E濃度為準(zhǔn),琥珀酸酐按照摩爾比加入)、反應(yīng)時(shí)間這3個(gè)因素作為自變量,以維生素E琥珀酸酯產(chǎn)率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析,各因素的水平設(shè)計(jì)見表3。采用Mintab15軟件選用Box-Behnken進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并以隨機(jī)順序進(jìn)行實(shí)驗(yàn),各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)設(shè)