不同提取工藝對產(chǎn)油酵母油脂產(chǎn)率的影響

不同提取工藝對產(chǎn)油酵母油脂產(chǎn)率的影響

微生物油主要由微生物通過碳?xì)浠衔锖铣?，其脂肪酸的組成與植物油相似。由于它能夠取代水生植物作為生物柴油生產(chǎn)的原料油，因此引起了人們的注意。本文主要以實驗室前期分離獲得的高產(chǎn)油酵母菌株JM-D為研究對象,比較了不同的預(yù)處理方法(酸熱法、細(xì)胞勻漿機破碎法、微波法、反復(fù)凍融法、超聲波清洗器法、超聲波細(xì)胞粉碎機法、研磨法和酶法)對產(chǎn)油酵母細(xì)胞破碎效果的影響,同時對兩種油脂提取方法進(jìn)行了比較(有機溶劑提取法與索氏抽提法),以期在提高微生物油脂產(chǎn)量和節(jié)約成本方面,為微生物細(xì)胞破碎和油脂提取的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的借鑒。1材料和方法1.1病毒產(chǎn)油酵母JM-D為實驗室篩選保藏菌種。前期研究1.2滅菌固體斜面培養(yǎng)基:于9°Brix麥芽汁中加入2%瓊脂,115℃滅菌20min。液體種子培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L,酵母膏10g/L,(NH液體發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖60g/L,酵母膏10g/L,蛋白胨3.5g/L,KH1.3化培養(yǎng)民警將冷凍保藏的產(chǎn)油酵母JM-D接種于固體斜面培養(yǎng)基上,于28℃活化培養(yǎng)72h;取2環(huán)活化菌接種于液體種子培養(yǎng)基中,于28℃、140r/min搖床培養(yǎng)12h后,以10%的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,于28℃、140r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)120h。1.4最適菌種的確定考慮到菌體含水量可能會對某些細(xì)胞破碎方法的效果產(chǎn)生影響,故在破碎之前準(zhǔn)備干濕兩種菌體。因此,發(fā)酵結(jié)束后,以3000r/min離心發(fā)酵液10min,所得菌體用蒸餾水清洗后離心,重復(fù)此操作2次,得濕菌體。取部分濕菌體在65℃干燥箱中烘干至恒重,得到產(chǎn)油酵母JM-D干菌體,菌體干重≈0.2×菌體濕重。1.5產(chǎn)油螺母jm-d的預(yù)處理1.5.1養(yǎng)殖脂質(zhì)蛋白的制備取3份濕菌體各2.5g,分別加入蒸餾水40mL制成菌懸液,調(diào)節(jié)pH5.0~6.0,并依次加入6、10、15mg/mL的蝸牛酶,置于45℃水浴中酶解4~6h,隨后加入菌懸液2倍體積的無水乙醇終止酶解反應(yīng),將反應(yīng)液移入具塞量筒中,進(jìn)一步用有機溶劑提取油脂1.5.2官液的制備分別稱取2.5g濕菌體3份置于小燒杯中,分別加入10mL蒸餾水制成菌懸液。以蒸餾水為介質(zhì),處理時間分別為5、10、15min。1.5.3濕菌體菌懸液的制備將GY92-II型超聲波細(xì)胞粉碎機調(diào)至:超聲時間15s、間隙時間20s、功率600W,工作次數(shù)為40。分別稱取2.5g濕菌體3份于小燒杯中,加入10mL蒸餾水制成菌懸液。將裝有菌懸液的小燒杯置于冰浴上并放入儀器內(nèi),處理時間分別為5、10、15min,從而完成對產(chǎn)油酵母JM-D的細(xì)胞破碎1.5.4解凍冷凍管分別稱取2.5g濕菌體3份放入3支離心管中,并各加入10mL蒸餾水制成菌懸液。放入-20℃冰箱冷凍12h。然后取其中1支冷凍管放入100℃水浴鍋內(nèi)水浴10min進(jìn)行解凍;1支冷凍管放在室溫條件下10min完全解凍;1支冷凍管放入微波爐中,調(diào)至“解凍”檔解凍30s,靜置1min,再進(jìn)行解凍30s,重復(fù)操作20次。最后將3支離心管再次放入-20℃冰箱冷凍12h再解凍,重復(fù)以上操作3次1.5.5漿機菌懸液的制備分別稱取2.5g濕菌體和0.5g干菌體各3份,分別置于細(xì)胞勻漿機專用圓底燒瓶中,向6組圓底燒瓶各加入10mL蒸餾水制成菌懸液。將細(xì)胞勻漿機轉(zhuǎn)速調(diào)至6000r/min,破碎處理時間分別為5、10、15min,從而達(dá)到對產(chǎn)油酵母JM-D細(xì)胞破碎的目的。1.5.6官液的制備分別稱取2.5g濕菌體3份于小燒杯中,分別加入10mL蒸餾水制成菌懸液。將微波爐調(diào)至“中火”檔,對3組菌懸液處理時間分別設(shè)置為5、10、15min。1.5.7提取油脂稱取干菌體0.5g,放入22mm×200mm大試管中,加入4mol/L鹽酸15mL,搖勻,放入沸水浴中1h,取出冷卻,以待進(jìn)一步提取油脂1.5.8研磨法稱取干菌體2g,放入研缽中研磨1h,取研磨后的干菌粉0.5g,準(zhǔn)備下一步提取油脂。1.6油提取采用有機溶劑(乙醚與石油醚)提取法2結(jié)果與分析2.1不同的破裂法對jm-d油的產(chǎn)量影響2.1.1犀牛酶破壁程度的測定采用不同加酶量的蝸牛酶進(jìn)行破壁處理,經(jīng)先乙醚后石油醚提取,所得油脂提取結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出,在加酶量為6~15mg/mL的范圍內(nèi),油脂產(chǎn)率先升高后降低,表明蝸牛酶的破壁程度也是先升高后降低。在10mg/mL蝸牛酶的條件下,油脂產(chǎn)量最大,達(dá)到0.242g,油脂產(chǎn)率也最高,為46.2%。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是較低的加酶量不能有效地破碎細(xì)胞,而加酶量過多會導(dǎo)致產(chǎn)物抑制而影響酶活,最終影響油脂產(chǎn)率2.1.2超聲波破碎細(xì)胞的產(chǎn)油結(jié)果分別采用超聲波清洗器和超聲波細(xì)胞粉碎機破碎濕菌體細(xì)胞,經(jīng)先乙醚后石油醚提取,所得油脂提取結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出,采用超聲波清洗器破碎菌體細(xì)胞10min,所提取的油脂產(chǎn)率最大,為35.2%;且采用超聲波清洗器破碎細(xì)胞比采用超聲波細(xì)胞粉碎機破碎細(xì)胞的效果好。從兩種超聲波破碎方法可以看出并非處理時間越長越好,兩種方法都在超聲破碎10min時油脂產(chǎn)率最大。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是超聲波處理時間較長時儀器產(chǎn)生熱量,部分油脂分解,油脂產(chǎn)率下降2.1.3解凍破碎細(xì)胞所提取的油脂產(chǎn)率采用1.5.4的方法破碎菌體細(xì)胞,經(jīng)先乙醚后石油醚提取,所得油脂提取結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出,在100℃水浴鍋中解凍破碎細(xì)胞所提取的油脂產(chǎn)率最大,為43.4%;其次是室溫條件下解凍的;而在微波爐中解凍破碎細(xì)胞的油脂產(chǎn)率最低,破碎細(xì)胞的效果最差。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是水浴鍋中解凍溫差相對較大,破碎細(xì)胞效果最好;而微波爐解凍溫度太高使部分油脂分解。2.1.4菌細(xì)胞的油脂提取利用細(xì)胞勻漿機的勻漿刀在高速旋轉(zhuǎn)過程中產(chǎn)生的機械切力,對產(chǎn)油酵母JM-D進(jìn)行物理破碎。采用1.5.5方法破碎菌體細(xì)胞,經(jīng)先乙醚后石油醚提取,所得油脂提取結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出,菌體是否為干菌體或濕菌體對細(xì)胞勻漿機破碎細(xì)胞的影響很小,破碎后提取所得油脂產(chǎn)量及油脂產(chǎn)率相差不大。當(dāng)干、濕菌體破碎時間為10min時,所得油脂產(chǎn)率最大,但最大值僅為7.1%,與超聲波破碎法、反復(fù)凍融法相比破碎效果較差,所得油脂產(chǎn)率較低。2.1.5反復(fù)凍融法提取細(xì)胞的產(chǎn)油結(jié)果微波破碎法是利用微波爐在加熱過程中產(chǎn)生的大量熱量,使菌體細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)等物質(zhì)發(fā)生變性,從而達(dá)到細(xì)胞破碎的效果。采用1.5.6方法破碎菌體細(xì)胞,經(jīng)先乙醚后石油醚提取,所得油脂提取結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出,在5~15min的處理時間內(nèi),當(dāng)處理10min時所得油脂產(chǎn)率較高,為3.6%,低于反復(fù)凍融(微波爐解凍法)處理的。微波法破碎濕菌體細(xì)胞的效果很差,油脂產(chǎn)率很低。其原因有可能是微波爐在加熱過程中產(chǎn)生的高溫使部分油脂分解,從而使油脂產(chǎn)量偏低。2.1.6酸熱法與研磨法破碎細(xì)胞的產(chǎn)油結(jié)果比較分別采用酸熱法、研磨法、研磨法+酸熱法相結(jié)合對干菌體細(xì)胞進(jìn)行破碎,再經(jīng)先乙醚后石油醚提取,所得油脂提取結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出,酸熱法破碎干菌體細(xì)胞所得油脂產(chǎn)率為34.6%,明顯高于研磨法,而研磨法+酸熱法破碎細(xì)胞所得油脂產(chǎn)率為37.8%,略高于采用酸熱法的。分析原因可能是由于單獨研磨時,菌體細(xì)胞與研缽的接觸點少,從而導(dǎo)致細(xì)胞破碎效果較差,油脂產(chǎn)量較低。而使用酸熱法破碎時,對菌體先進(jìn)行研磨處理能使菌體細(xì)胞充分與酸接觸,破碎效果最好,從而油脂產(chǎn)量最高。因此,采用復(fù)合細(xì)胞破碎方法所得油脂產(chǎn)量要高于使用單一破碎方法的油脂產(chǎn)量。2.2索氏抽法提取脂選擇酸熱法及研磨法處理干菌體細(xì)胞,再分別采用索氏抽提法、有機溶劑(先乙醚后石油醚)提取法提取菌體油脂,結(jié)果如表1所示。由表1可以看出,采用研磨法破碎細(xì)胞,后采用索氏抽提法所得菌體油脂產(chǎn)量明顯高于有機溶劑提取所得油脂產(chǎn)量。其原因可能是有機溶劑提取法利用有機溶劑溶解油脂的時間較索氏抽提法的短,而索氏抽提法是利用有機溶劑反復(fù)萃取油脂的方法,萃取油脂比較徹底,因此采用索氏抽提法所得菌體油脂產(chǎn)量相對最高,油脂產(chǎn)率也相對最大,為44.0%。該方法缺點是操作比較耗時,但其提取過程中乙醚可以回收利用,可以減少油脂提取成本。而采用酸熱法破碎細(xì)胞后再經(jīng)有機溶劑提取所得油脂產(chǎn)量僅次于索氏抽提法的,可見,采用適當(dāng)?shù)募?xì)胞破碎方法及油脂提取方法對油脂產(chǎn)量及油脂產(chǎn)率影響較大。3反復(fù)凍融法破碎細(xì)胞的產(chǎn)油結(jié)果在8種菌體破碎方法中,蝸牛酶法破碎JM-D酵母細(xì)胞的效果最好,利用蝸牛酶破碎細(xì)胞后再經(jīng)先乙醚后石油醚提取所得油脂產(chǎn)率最大,最大值為46.2%;其次是反復(fù)凍融(100℃水浴解凍)法,油脂產(chǎn)率為43.4%。研磨法+酸熱法破碎細(xì)胞后油脂提取效果也比較好