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精品文檔-下載后可編輯預(yù)先鞘內(nèi)給予新斯的明對(duì)切口疼痛大鼠的影響【摘要】目的探討預(yù)先鞘內(nèi)給予新斯的明對(duì)切口疼痛大鼠行為學(xué)的影響。方法①采用序貫法測(cè)定預(yù)先鞘內(nèi)給予新斯的明對(duì)切口疼痛大鼠鎮(zhèn)痛作用的ED50值;②預(yù)先鞘內(nèi)給予新斯的明對(duì)切口疼痛大鼠痛行為學(xué)的影響;③運(yùn)用免疫組化技術(shù)觀察新斯的明對(duì)脊髓背角c-fos基因表達(dá)的影響。結(jié)果①預(yù)先鞘內(nèi)給予新斯的明對(duì)切口疼痛大鼠鎮(zhèn)痛作用的ED50值為8.36μg,95%可信區(qū)間為6.68~10.70μg;②手術(shù)組大鼠累積疼痛評(píng)分明顯高于F組,預(yù)先IT新斯的明可明顯降低術(shù)后疼痛引起的累積疼痛評(píng)分;③與S組相比,新斯的明ED50量明顯抑制c-fos蛋白的表達(dá),作用主要產(chǎn)生在Ⅰ~Ⅱ?qū)印ⅱ酢鰧?以Ⅰ~Ⅱ?qū)臃植甲疃?。結(jié)論①預(yù)先新斯的明5~15μg鞘內(nèi)應(yīng)用可產(chǎn)生劑量依賴性的抗傷害作用;②預(yù)先鞘內(nèi)注射新斯的明的抗傷害作用與抑制c-fos蛋白的表達(dá)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】新斯的明;鞘內(nèi)注射;切口疼痛模型;C-Fos基因
Theeffectofpreemptiveintrathecalneostigmineonaratmodelofpostoperativepain
GUOYun-he.
SurgeryDepartment,MedicalCollegeofDatongUniversity,Shanxi037009,China
【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofpreemptiveintrathecalneostigminginaratmodelofpostoperativepain.Methods①InvestigationoftheED50(medianeffectivedose)valueofantinociceptionofpreemptiveintrathecalneostigmingbyDixon’supanddownmethodinaratmodelofpostoperativepain;②theefectofpreemptiveintratheca1neostigmingonthenociceptivebehaviorsinratsofpostoperativepain;②immunohistochemistrytechniquewasinvolvedinobservingc-fosproteinexpressionatspinallevel.Results①TheED50valueofantinociceptionofpreemptiveintrathecalneostigmingintheratofmodelofpostoperativepainwas8.36μg,CI(6.68~10.70)μg;②thecumulativepainscoresofratsinoperationgroupweremuchhigherthanthoseofF-operationratsandpreemptiveintrathecalneostigmingdecreasedcumulativepainscoressignificantly;③whenneostigmingwereusedatthedoseofED50,theycouldsignificantlyrepresstheexpressionofc-fosprotein.TheirfunctionalpositionswereattheLayerⅠ-ⅡandⅤ-Ⅵ.ConclusionsPreemptiveintrathecalneostigmingatthedoseof1to10μgcanproducedose-dependantantinociception;②theantinociceptiveeffectsofpreemptiveintrathecalneostigminearemediatedpartlybyinhibitionofc-fosprotein.
【Keywords】Neostigming;Intrathalinjection;Postoperativepainrats;C-Fosprotein
單位:037009山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院外科教研室
新斯的明(NEO)是一種膽堿酯酶抑制劑,近幾年實(shí)驗(yàn)和臨床研究均顯示鞘內(nèi)(IT)NEO具有明顯的抗傷害作用和鎮(zhèn)痛作用[1]。本研究探討預(yù)先鞘內(nèi)給予新斯的明對(duì)切口疼痛大鼠行為學(xué)的影響,為進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。
1材料和方法
1.1藥品和試劑新斯的明注射液(Neostigmine上海信誼金朱藥業(yè)有限公司);羊抗兔c-fos多克隆抗體、PV-6001試劑盒、DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);異氟醚(isoflurane,Rhone-Poulenc);麻醉機(jī)(Dragen),鞘內(nèi)置管,體質(zhì)量250~300g的雄性SD大鼠,由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。以5%的水合氯醛0.6ml/100kg腹腔注射麻醉后,按楊建平法[2]在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔植入PE10聚乙烯導(dǎo)管(實(shí)驗(yàn)藥物均經(jīng)所埋導(dǎo)管注入蛛網(wǎng)膜下腔),妥善固定,術(shù)畢給予20g/L利多卡因注射液20μl。凡是10s內(nèi)兩后肢不能負(fù)重、拖地以及針刺小腿無(wú)回縮等逃避反應(yīng),16~20min以后又恢復(fù)負(fù)重者為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,飼養(yǎng)5d后用于實(shí)驗(yàn)。
1.2切口疼痛模型的建立大鼠吸入1.4%異氟醚麻醉后,將其左后爪進(jìn)行消毒,按Brerman等[3]法從足底近端0.5cm處向趾部作一長(zhǎng)約1cm的切口。切開皮膚,用眼科鑷挑起足底肌肉并縱向切割,保持肌肉的起止及附著完整,按壓止血,用細(xì)線縫合皮膚共兩針即成切口疼痛模型。
1.3行為學(xué)實(shí)驗(yàn)采用累積疼痛評(píng)分法[3]評(píng)定疼痛強(qiáng)度,待大鼠手術(shù)清醒后觀察兩后爪著地及負(fù)重情況,后爪被壓迫發(fā)白表示負(fù)重,如后爪翹起不著地,記2分;如后爪著地但不負(fù)重,記1分;如后爪著地并且負(fù)重,記0分。從術(shù)后1h起每5min觀察1次,每次1min,以1min內(nèi)最常采取的姿勢(shì)為標(biāo)準(zhǔn),共觀察1h(1~24分),以術(shù)側(cè)足評(píng)分減去對(duì)側(cè)足評(píng)分即為所得累積疼痛評(píng)分。
1.4序貫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及確定的有效指標(biāo),預(yù)先鞘內(nèi)給予新斯的明對(duì)切口疼痛大鼠鎮(zhèn)痛作用的ED50值可能在5~15μg范圍,以此范圍為準(zhǔn),采用等比系數(shù)(r)為1.316,設(shè)立5個(gè)劑量即5、6.6、8.7、11.4、15μg,取20只大鼠用于序貫實(shí)驗(yàn)為新斯的明組;另有一組為生理鹽水(0.9%Saline)對(duì)照組,為5只大鼠,計(jì)為S組。所有大鼠均按隨機(jī)分配原則入組,而給藥時(shí)采用單盲法。
1.5c-fos檢測(cè)動(dòng)物分組根據(jù)序貫實(shí)驗(yàn)計(jì)算出預(yù)先鞘內(nèi)給予新斯的明的ED50量。取置管成功SD大鼠15只,隨機(jī)分為三大組,Neo組、S組、F組。Neo組預(yù)先鞘內(nèi)注射新斯的明ED50量行切口術(shù),S組注鹽水無(wú)藥物,行切口術(shù)方法;F組不做手術(shù)只注鹽水。組織采集和樣本制備Fos表達(dá)的高峰時(shí)間為術(shù)后2h,因此切口疼痛模型建立2h后采用5%水合氯醛(0.6ml/kg)麻醉,開胸,暴露心臟,經(jīng)左心室灌流固定。先用200ml0.9%生理鹽水快速灌流沖洗血液,繼以4%多聚甲醛500ml(0.1mol/L磷酸鹽緩沖液,pH7.4)持續(xù)灌注1h左右,接著灌入300ml的20%蔗糖和0.1mol/L磷酸鹽緩沖液的混合液。剪開椎板取腰膨大處脊髓在4%多聚甲醛中后固定2h,而后放人20%的蔗糖PBS液中,置4℃冰箱過夜。冰凍冠狀連續(xù)切片,片厚20μm,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌(3次,5min/次),3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧酶37℃暖箱中孵育30min,加一抗(c-fos抗體1∶800),37℃濕盒孵育5h,4℃冰箱過夜滴加二抗(羊抗兔),37℃孵育1h,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌(3次,5min/次),DAB顯色30min,自來(lái)水充分沖洗,脫水、封固鏡檢,核內(nèi)棕色顆粒為陽(yáng)性產(chǎn)物,每組各有一張加PBS液替代c-fos一抗,作為免疫組化的陰性對(duì)照。
1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)。P
2結(jié)果
2.1序貫實(shí)驗(yàn)
2.1.1預(yù)先鞘內(nèi)注射新斯的明對(duì)切口疼痛大鼠鎮(zhèn)痛作用的ED50值測(cè)定,對(duì)照組累積疼痛評(píng)分值17±2.9,以累積疼痛評(píng)分8.5為鎮(zhèn)痛有效指標(biāo)做出序貫實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見表1表2),根據(jù)計(jì)算公式得出新斯的明的ED50為8.36μg,95%可信區(qū)間為6.68~10.70μg。
表1
預(yù)先鞘內(nèi)應(yīng)用新斯的明序貫實(shí)驗(yàn)結(jié)果
劑量(μg)1234567891011121314151617181920
15.0++
11.4++-+
8.7+-+-+++
6.6-+---+
5.0-
表2
預(yù)先鞘內(nèi)應(yīng)用新斯的明的ED50及95%可信區(qū)間
新斯的明劑量D
Dose(μg)對(duì)數(shù)劑量X
logdose(lgD)
組內(nèi)動(dòng)物數(shù)
+-
niinin2ED50(μg)95%可信區(qū)間(μg)
15.01.176200400
11.41.057311339
8.70.940522248
6.60.820244144
5.00.699011000
合計(jì)128811218.366.68~10.70
2.1.2序貫法預(yù)先鞘內(nèi)給予新斯的明對(duì)切口疼痛大鼠行為學(xué)的影響。對(duì)照組大鼠的術(shù)側(cè)足常翹起,偶爾著地,但極少負(fù)重;Neo組術(shù)側(cè)足均可著地,并且負(fù)重。與對(duì)照組相比,預(yù)先鞘內(nèi)注射Neo組可明顯降低累積疼痛評(píng)分(P
2.2脊髓灰質(zhì)內(nèi)C-Fos陽(yáng)性表達(dá)的結(jié)果
2.2.1兩藥對(duì)切口疼痛大鼠行為學(xué)的影響
F組大鼠活動(dòng)如常,雙后爪著地且負(fù)重;S組大鼠的術(shù)側(cè)足常翹起,偶爾著地,但極少負(fù)重;Neo組術(shù)側(cè)足均可著地,并且負(fù)重。與F組相比,手術(shù)組大鼠累積疼痛評(píng)分均明顯升高(P
2.2.2兩藥對(duì)FIL-N的影響S組大鼠于左爪按Brennan法行手術(shù)前只注入NS,可使同側(cè)L4-L6脊髓灰質(zhì)c-fos蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),c-fos免疫陽(yáng)性反應(yīng)神經(jīng)元(FLI-N)在各層均有分布,但主要分布在Ⅰ~Ⅱ?qū)?、Ⅴ~Ⅵ?以Ⅰ~Ⅱ?qū)臃植甲疃?。Neo組明顯抑制FLI-N的產(chǎn)生,作用主要產(chǎn)生在Ⅰ~Ⅱ?qū)?、Ⅴ~Ⅵ層?/p>
3討論
序貫法是一種探討用藥劑量或濃度的經(jīng)典方法[4]。本研究采用此方法探討預(yù)先鞘內(nèi)注射新斯的明對(duì)切口疼痛大鼠產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用的有效劑量。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出,預(yù)先鞘內(nèi)給予新斯的明動(dòng)物陽(yáng)性和陰性變化比較集中,故結(jié)果重復(fù)性較好,可靠。
本實(shí)驗(yàn)采用的外周傷害性刺激模型系大鼠切口疼痛模型,此模型是由Brennan等于1997年提出的,施行此手術(shù)的大鼠表現(xiàn)自發(fā)性疼痛行為、機(jī)械性異常疼痛、機(jī)械性痛覺過敏,這些疼痛行為與臨床上外科手術(shù)和術(shù)后狀態(tài)一致[3,5]。
新斯的明(NEO)是一種膽堿酯酶抑制劑,有研究證實(shí)脊髓背角Ⅲ、Ⅳ和存在有含Ach的神經(jīng)元細(xì)胞體,其軸突伸向背角層,其內(nèi)在神經(jīng)元可與傷害性初級(jí)傳入纖維形成突觸聯(lián)系,調(diào)節(jié)傷害性刺激的傳入[6]。筆者的實(shí)驗(yàn)觀察到預(yù)先在大鼠切口疼痛模型中IT注射NEO可使大鼠累積疼痛評(píng)分明顯降低,表明預(yù)先NEO鞘內(nèi)應(yīng)用有確切的鎮(zhèn)痛效果,并呈劑量依賴性;同時(shí)脊髓背角Ⅰ~Ⅱ?qū)?、Ⅴ~Ⅵ層FLI-N陽(yáng)性神經(jīng)元均較對(duì)照組明顯減少,提示在脊髓膽堿能鎮(zhèn)痛機(jī)制中c-fos蛋白的抑制發(fā)揮著重要作用。
參考文獻(xiàn)
[1]HwangJH,HwangKS,LeemJR,etal.Theantiallodynicefectsofintrathecalcholinesteraseinhibitorsinaratmodelofneuropathicpain.Anesthesiology,1999,90:492-9.
[2]楊建平,蔣豪,吳玨.大鼠蛛網(wǎng)膜下腔埋管并長(zhǎng)期留置操作的改進(jìn).中華麻醉學(xué)雜志,1993,13:110-112.
[3]BrennanTJ,VandenneulenEP,GebhanGF.Characterizationofaratmodelofineisionalpain.Pain,1996,64:493-501.
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