基于石英晶體阻尼效應(yīng)的內(nèi)毒素壓電生物傳感器

基于石英晶體阻尼效應(yīng)的內(nèi)毒素壓電生物傳感器

1內(nèi)毒素檢測(cè)法內(nèi)毒素（et）是一種源于革蘭氏陰性病原體的光源藥物。這是傷口、燒傷、休克和并發(fā)癥中重要的異質(zhì)生物。其有效的激活成分是脂肪糖（ls），是中毒性休克過(guò)程中產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)的重要手段之一。極低濃度的內(nèi)毒素就會(huì)影響某些細(xì)胞的正常生理活動(dòng),導(dǎo)致人體或動(dòng)物嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。對(duì)藥物、水源、食品、醫(yī)療器械及生物制品生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制以及最終產(chǎn)品的質(zhì)量鑒定進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè),可嚴(yán)格控制其內(nèi)毒素含量從而保障人民的身體健康。家兔熱源法是最早的內(nèi)毒素檢測(cè)方法,由于該方法存在定量性差、費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)有被逐漸淘汰的趨勢(shì)。國(guó)內(nèi)外現(xiàn)采用的鱟試劑法(Limulustest)是基于鱟的變形細(xì)胞溶解物(Limulusamebocytelysate,LAL)對(duì)LPS極其敏感,極少量的LAL能與之作用產(chǎn)生凝膠反應(yīng)。根據(jù)凝膠形成時(shí)間或凝膠形成時(shí)發(fā)生的吸光度變化來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素的濃度。該方法是半定量法,且存在諸如響應(yīng)慢、自動(dòng)化程度低以及最低檢測(cè)限偏高(約1pg/ml)等缺點(diǎn)。本文的研制的內(nèi)毒素生物傳感器利用了ET與LAL凝膠反應(yīng)過(guò)程引起液體流變學(xué)性質(zhì)(黏度和密度)的變化,同時(shí)結(jié)合了壓電石英晶體能極其靈敏的響應(yīng)這一變化的特點(diǎn)。2結(jié)晶劑為單一觸液的穩(wěn)定反應(yīng)壓電傳感器是利用壓電材料為基底的體聲波(Bulkacousticwave,BAW)器件在厚度剪切模式(Thickshearmode,TSM)振蕩過(guò)程中與環(huán)境的相互作用,由器件的超高頻聲波的聲阻抗譜、頻譜或相位等的參量變化來(lái)對(duì)環(huán)境介質(zhì)包括質(zhì)量、黏彈性、導(dǎo)納、介電等物理、化學(xué)性能做出相關(guān)應(yīng)答并轉(zhuǎn)換為相應(yīng)傳感檢測(cè)信號(hào)。最早用于氣相環(huán)境下的石英晶體微天平(Quartzcrystalmicrobalance,QCM)正如其字面意思,是一種質(zhì)量負(fù)載效應(yīng)型傳感器。其基本原理是吸附于晶體電極表面的質(zhì)量變化與晶體諧振頻率變化成正比。這一關(guān)系式即是著名的Sauerbrey頻率—質(zhì)量公式:Δf1=-2f2ΔΜA√ρqμq(1)Δf1=?2f2ΔMAρqμq√(1)式中:Δf1為由于質(zhì)量負(fù)載效應(yīng)引起的頻率改變量(Hz);f為石英晶體振蕩基頻(MHz);ΔM為被晶體吸附的外源物質(zhì)的質(zhì)量(g);A為電極區(qū)面積(cm2);μq與ρq分別為石英晶體彈性模量和密度。但在生命科學(xué)和其他領(lǐng)域研究中,常常需要在液相中進(jìn)行。大量研究表明石英晶體諧振器在置于液相環(huán)境時(shí),晶體的頻率變化除與上述質(zhì)量負(fù)載效應(yīng)(Massloadingeffect)有關(guān)外,還與晶體周圍液體的機(jī)械特性(黏度、密度、電導(dǎo)率以及介電常數(shù)等)有關(guān)。此效應(yīng)被稱為液體阻尼效應(yīng)(Liquiddampingeffect)。當(dāng)晶體為單面觸液時(shí),由于晶體等效電路中的電學(xué)端未受影響,從而液體阻尼效應(yīng)僅與液體的黏度、密度有關(guān)。此時(shí)可由Kanazawa-Gorden方程表示如下:Δf2=-f1.5√ρ1η1πρqμq(2)Δf2=?f1.5ρ1η1πρqμq????√(2)式中:Δf2為液體阻尼效應(yīng)引起的頻移量(Hz);ρ1、η1分別為液體的密度和黏度;其他符號(hào)含義同(1)式。所以在單面觸液石英晶體諧振器中,晶體總頻移量Δf為:Δf=Δf1+Δf2(3)μg/ml內(nèi)毒素濃度以下的水溶液,其黏度和密度變化相差甚微,由(2)式可知其頻移值相差也很小。但是當(dāng)加入一定量的LAL溶液后,由于LAL與ET存在凝膠反應(yīng),不同內(nèi)毒素濃度溶液的黏度差異將被放大,同時(shí),與之相應(yīng)的凝膠反應(yīng)形成時(shí)間也存在差異。而石英晶體諧振器的諧振頻率變化則可以靈敏的響應(yīng)這些變化。根據(jù)標(biāo)定不同的頻移值以及頻移變化趨勢(shì)等參數(shù)就可以反推得到內(nèi)毒素的濃度。不過(guò),從式(3)中可以發(fā)現(xiàn)晶體頻移還與晶體質(zhì)量負(fù)載效應(yīng)有關(guān),后文將說(shuō)明如何降低或消除這一項(xiàng)的影響。3晶體結(jié)構(gòu)及測(cè)量原理傳感器探頭晶片的選擇、表面處理以及探頭結(jié)構(gòu)等都對(duì)晶體振蕩器性能起著關(guān)鍵作用。晶片的切型、直徑以及厚度等參數(shù)共同決定晶體振蕩器的性能。石英晶體有多種切型。而AT切型的晶體頻溫特性好,在-55℃～85℃內(nèi)頻率與溫度幾乎沒(méi)有關(guān)系;再者該切型比其他切型(如X、BT)的響應(yīng)靈敏度高,所以選擇AT切型。研究表明,晶片電極直徑過(guò)小,晶體不易啟振;過(guò)大易激勵(lì)寄生振蕩和產(chǎn)生跳頻。所以綜合考慮選擇晶片直徑為14mm,被金電極直徑為8mm。晶片的厚度與晶體基頻成反比,厚則基頻低,靈敏度降低;薄雖基頻高,靈敏度增加,但易脆且不易加工。本研究選擇采用晶體基頻為10MHz。同時(shí)晶片表面狀況也是一個(gè)值得考慮的問(wèn)題,本研究主要考慮晶片表面的粗糙度以及表面親和性質(zhì)(親水性或疏水性)這兩方面對(duì)傳感器響應(yīng)特性的影響。在電子顯微鏡下可以觀察到一個(gè)未經(jīng)表面處理的晶片表面有許多溝槽。晶體在液體中振蕩時(shí),溝槽內(nèi)會(huì)充滿液體,這部分液體會(huì)隨晶體表面運(yùn)動(dòng),相當(dāng)于額外增加了質(zhì)量負(fù)載效應(yīng)的影響,這一效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致晶體頻移的增加,從而產(chǎn)生測(cè)量誤差。另外對(duì)于水性溶液,如果晶體表面親水性低,則液體與晶體表面的液固耦合性能差,從而影響傳感器信號(hào)的響應(yīng)靈敏度。根據(jù)以上分析,本研究采用聚苯乙烯的氯仿溶液涂覆在金電極表面,在涂覆時(shí)保持整個(gè)電極區(qū)的同質(zhì)性和均一性,以確保表面的光滑和傳感器響應(yīng)的穩(wěn)定性。為了進(jìn)一步提高涂層的親水性,把涂覆好的晶體置于紫外燈下照射5min左右。經(jīng)過(guò)處理后的晶體如圖1(a)所示。圖1(b)為探頭具體結(jié)構(gòu)示意圖。晶體采用單面觸液方式是為了減小液體阻尼。因?yàn)槭⒕w諧振器兩面與ET—LAL混合液接觸后,液體阻尼過(guò)大,晶體的Q值下降很多,頻率的選擇性會(huì)變差甚至停振。再者,探頭的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)還必須保證液相環(huán)境下晶體的穩(wěn)定振蕩。所以本研究對(duì)探頭的設(shè)計(jì)原則是:探頭引線盡量短,電極引線用導(dǎo)電膠粘接在晶片邊緣倒角處以加強(qiáng)振蕩的穩(wěn)定性。另外,在保證液體不滲入晶片另一面情況下,盡量減小密封應(yīng)力和密封形式對(duì)晶體振蕩參數(shù)的影響。加入電磁攪拌器是為了讓ET—LAL混合液在較短時(shí)間內(nèi)混合均勻。整個(gè)測(cè)量探頭還必須置于恒溫水套中。這是因?yàn)椴煌臏囟葪l件對(duì)凝膠反應(yīng)進(jìn)程以及混合液粘度值均有較大的影響。實(shí)驗(yàn)中水套溫度保持在37℃±0.2℃。4工作晶體的特性液相環(huán)境中的石英晶體振蕩電路可以采用晶體管,也可以采用集成電路。后者具有線路簡(jiǎn)單、結(jié)構(gòu)緊湊、性能穩(wěn)定、可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)。由于晶體在使用過(guò)程中不可避免的存在溫漂和時(shí)漂,這些均會(huì)導(dǎo)致頻率測(cè)量的誤差,為提高頻率測(cè)量的準(zhǔn)確性和可靠性,采用兩片特性完全相同的晶體,一片做參考晶體(Cry1),另一片做工作晶體(Cry2)。兩者的頻差分別進(jìn)入差頻器74LS74的CLK端和D端,得到的差頻信號(hào)進(jìn)入頻率計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。合理選擇電路中的電容和電阻值可以保證晶體穩(wěn)定振蕩并避免自激和寄生振蕩。其具體電路原理如圖2所示。5內(nèi)毒素的濃度對(duì)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)的影響利用研制的石英晶體振蕩器,我們對(duì)壓電石英晶體在ET—LAL溶液中的頻率變化與不同內(nèi)毒素濃度之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。由頻率計(jì)數(shù)器得到的頻率信號(hào)通過(guò)RS—232串行通訊端口接入PC機(jī),通過(guò)編程(主要包括:串行通訊子程序、數(shù)據(jù)顯示以及數(shù)據(jù)分析子程序)以便實(shí)現(xiàn)頻率變化曲線顯示以及數(shù)據(jù)分析處理和結(jié)果顯示。實(shí)驗(yàn)中,首先把內(nèi)毒素(O128:B12)溶解在去內(nèi)毒素水中并配置成濃度為20ng/ml的溶液,然后分別稀釋為:10ng/ml、1ng/ml、100pg/ml、10pg/ml、1pg/ml、0.1pg/ml、0.01pg/ml的濃度各6ml。LAL用鱟試劑水(LRW)稀釋(按供應(yīng)商的要求)備用。在每一次測(cè)量時(shí)加入相同體積的LAL溶液。每一個(gè)濃度測(cè)量三次,頻移值取其平均值作為測(cè)量結(jié)果。為了避免上次測(cè)量結(jié)果對(duì)下次測(cè)量結(jié)果的影響,在每測(cè)量一個(gè)樣品濃度前均用0.1mol/l的鹽酸和去內(nèi)毒素水清洗3次以確保晶體表面沒(méi)有黏附物質(zhì)。由于石英晶體傳感器的質(zhì)量負(fù)載效應(yīng)對(duì)測(cè)量結(jié)果影響較大,在經(jīng)過(guò)處理后的晶體表面對(duì)對(duì)溶液中的物質(zhì)究竟有沒(méi)有吸附,為此我們首先進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)論證。把石英晶體諧振器置于20ng/ml的內(nèi)毒素溶液,同時(shí)加入LAL溶液,待頻率穩(wěn)定后(約10～18min)。取出晶體,用去內(nèi)毒素水輕輕洗滌3次,自然涼干后,測(cè)量其頻率變化,同未置入溶液前比較。其頻率變化僅80Hz左右。而其液體阻尼效應(yīng)產(chǎn)生的頻移一般為幾千Hz,所以可以認(rèn)為經(jīng)處理后的晶體表面幾乎沒(méi)有質(zhì)量負(fù)載效應(yīng)。圖3為石英晶體諧振器放入ET—LAL混合溶液后,不同濃度下的頻移響應(yīng)曲線,從圖中可以發(fā)現(xiàn),內(nèi)毒素濃度愈大,頻率穩(wěn)定愈快,頻移也愈大。其最大頻移值與對(duì)數(shù)濃度的關(guān)系如圖5所示。二者之間有較好的線性關(guān)系(除0.01pg/ml外),其關(guān)系可以用下式表示:Δf=-7907.6-969.4logC。從圖4中可以看出內(nèi)毒素濃度在0.1pg/ml～10ng/ml的6個(gè)數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)對(duì)數(shù)濃度值與最大頻移有非常好的線性關(guān)系。其相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9962。但在0.01pg/ml濃度下頻移值與線性擬合曲線有較大的偏差。我們還可以從圖3發(fā)現(xiàn),如果僅以最大頻移值作為測(cè)量值,則檢測(cè)時(shí)間將非常長(zhǎng)(在0.01pg/ml將長(zhǎng)達(dá)3h),所以非常有必要考慮采用其他參量作為測(cè)量值。從圖3不難發(fā)現(xiàn),不同的內(nèi)毒素濃度在頻移變化過(guò)程中大致可以分為3個(gè)階段。第一階段為晶體諧振器放入ET-LAL溶液后頻率將維持1～5min的穩(wěn)定,這一階段主要是由晶體響應(yīng)時(shí)間滯后造成的,這是晶體自身的物理特性所決定的。第二階段表現(xiàn)為頻移的快速下降,這主要是溶液液體阻尼效應(yīng)對(duì)諧振器作用的階段,也是信息量最多的階段,這一階段可以理解為凝膠逐漸在晶面附近形成液體阻尼層,從而影響晶體的振蕩行為。第三階段是頻移量達(dá)到最大后的保持階段。這一階段可理解為液體阻尼效應(yīng)完全釋放(即液體阻尼層形成的完成)而全部作用于晶體表面的結(jié)果。濃度愈小,三階段的劃分就愈不明顯,但第二階段的趨勢(shì)總存在。從圖3中各變化趨勢(shì)線的第二階段發(fā)現(xiàn)諸如某一測(cè)量時(shí)刻對(duì)應(yīng)的頻移值、某一頻移值對(duì)應(yīng)的時(shí)刻以及最大頻移時(shí)間微分值d(Δf)dtmaxd(Δf)dtmax出現(xiàn)時(shí)刻等與內(nèi)毒素濃度都存在一定的依賴關(guān)系。本文僅以最大頻移時(shí)間微分值出現(xiàn)時(shí)刻與內(nèi)毒素濃度的關(guān)系進(jìn)行分析。通過(guò)把圖3中的7條曲線的測(cè)量值在MATLAB軟件中先進(jìn)行數(shù)據(jù)平滑濾波處理后,再進(jìn)行微分處理,得出的每一曲線中的d(Δf)dtmaxd(Δf)dtmax出現(xiàn)時(shí)刻與內(nèi)毒素對(duì)數(shù)濃度之間做出的關(guān)系曲線如圖5所示。其擬合曲線表達(dá)式為:T=86.07-16.07logC。式中,T為d(Δf)dtmaxd(Δf)dtmax出現(xiàn)時(shí)刻,從圖中可以發(fā)現(xiàn),d(Δf)dtmaxd(Δf)dtmax出現(xiàn)時(shí)刻與內(nèi)毒素濃度有較好的線性關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)為R=0.9953。與前一種處理方法相比,采用這種處理方法有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn):一是拓寬了檢測(cè)下限,對(duì)于0.01pg/ml的濃度也存在較好的線性關(guān)系;二是縮短了檢測(cè)時(shí)間,對(duì)于0.01pg/ml的濃度在100～110min就可以得出測(cè)量結(jié)果(比前一方法縮短60～80min)。當(dāng)檢測(cè)一未知濃度時(shí),根據(jù)其最大頻移值或最大頻移微分值出現(xiàn)時(shí)刻,利用上述的回歸曲線