TRIM74對流感病毒復制機制影響的研究

TRIM74對流感病毒復制機制影響的研究

葉苗苗，孫楠，李奇兵，石文軍，王波，王廣文，姜麗，陳化蘭，李呈軍（中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/農業(yè)農村部動物流感重點開放實驗室，黑龍江哈爾濱150069）流感病毒作為一種重要的人畜共患病毒，在感染人畜后常引起上呼吸系統(tǒng)疾病，具有季節(jié)性和地方性流行的特征，且存在禽流感病毒（Avianinfluen?zavirus，AIV）跨物種感染人的病例，因此對人畜健康和養(yǎng)禽業(yè)經濟發(fā)展造成重大威脅。該病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬，根據其核蛋白（NP）和基質蛋白（M1）抗原性的不同，分為A（甲）、B（乙）、C（丙）、D4型[1]。此外，基于病毒表面抗原HA和NA的抗原特性，可以將流感病毒分為H亞型和N亞型，迄今為止，已發(fā)現至少18個HA亞型和11個NA亞型[2]。流感病毒粒子表面有囊膜，呈多形性，含8個編碼病毒蛋白的單股負鏈RNA片段，且每個RNA片段都能與一個核蛋白NP和一個聚合酶組成一個病毒核糖核蛋白復合體（vRNP）[3]，該結構是流感病毒基因組轉錄和復制的基本單位。現有的研究表明，流感病毒通過與宿主蛋白形成復雜的互作網絡進而對病毒的復制產生正向或負向的選擇壓力，從而在病毒基因組的復制、病毒粒子的組裝以及子代病毒粒子的釋放等多個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。因此，深入挖掘影響流感病毒復制的宿主依賴因子（Hostdepen?dentfactors，HDFs）并闡明其作用機制，將有利于完善宿主與流感病毒間的互作網絡，并明確宿主因子參與流感病毒復制周期的階段，從而為流感的防控與治療提供理論依據。三基序（Tripartitemotif，TRIM）家族蛋白泛指一類N端結構域排列高度保守的E3泛素連接酶，該類蛋白N端包含RING-B-box-coiled-coil結構域，又稱RBCC結構域；C端包含高度可變的結構域，是每種TRIM蛋白的特異性標志[4]。TRIM家族蛋白存在于所有真核生物體內，且其數量與物種等級密切相關。研究表明，蒼蠅基因組編碼約10種TRIM蛋白，豬基因組編碼約57種TRIM蛋白，而人類基因組編碼超過80種TRIM蛋白，這些蛋白廣泛參與細胞周期、增殖、凋亡、分化、基因表達、轉錄調節(jié)、信號傳遞、損傷修復、炎癥反應等生命活動的調控[4-5]。近年來，TRIM家族蛋白在抗病毒和先天免疫信號調節(jié)中發(fā)揮作用的研究成為熱點，已有研究發(fā)現部分TRIM家族蛋白以不同的方式調控流感病毒的復制，如TRIM22能夠通過與流感病毒核蛋白NP的互作使NP發(fā)生泛素化降解從而抑制流感病毒的復制[6]；TRIM14可以有效阻斷核蛋白NP從細胞質易位到細胞核，從而抑制流感病毒在宿主細胞中的傳播[7]；TRIM35通過激活腫瘤壞死因子受體相關因子3（Tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor3，TRAF3）以及降解流感病毒PB2蛋白負調控流感病毒的復制[8]。TRIM74是TRIM家族蛋白中的成員，目前尚無TRIM74與病毒、TRIM74與宿主天然免疫反應相關的研究報道，其功能尚待探究。根據TRIM74C端的可變區(qū)，將其劃分至TRIM家族第Ⅴ-2亞類，與TRIM74同處于該亞類的TRIM家族蛋白有TRIM31、TRIM40、TRIM56，對這幾個TRIM蛋白的研究較廣泛，并且它們分別靶向宿主先天性免疫反應信號通路中的不同接頭分子[9-11]，其中TRIM56可以通過阻礙病毒RNA的合成進而抑制甲型和乙型流感病毒的復制[12]。TRIM74是否與處于同一亞類的上述TRIM具有相似功能尚不清楚。因此，本研究通過siRNA干擾TRIM74的表達；同時通過慢病毒包裝過表達系統(tǒng)構建表達TRIM74的細胞系，分別利用該細胞系及轉染TRIM74表達質粒上調TRIM74的表達，探究TRIM74蛋白對流感病毒復制及干擾素信號通路的影響，為進一步了解TRIM74蛋白的功能提供數據參考。1材料與方法1.1病毒、細胞及質粒AIVA/WSN/1933（H1N1）株（以下簡稱WSN株）、仙臺病毒（SeV）、干擾素刺激反應原件（ISRE）啟動子熒光素酶報告質粒pISRELuc由中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室保存；IFN-β啟動子熒光素酶報告質粒pIFN-β-Luc購自Addgene公司；人非小細胞肺癌細胞（A549）購自ATCC公司；人胚胎腎細胞（HEK293T）和犬腎傳代細胞（MDCK）、pCDNA3.1載體、pCDNA3.1-TRIM74-V5表達質粒（簡稱pTRIM74-V5）、海參熒光素酶質粒pRL-TK、慢病毒過表達載體pLVX-IRES-ZsGreen1（簡稱pLVX）以及輔助質粒pASPI2、pMDG2均由本實驗室保存。1.2抗體及主要試劑poly(I:C)購自Invivogen公司，終濃度為0.5μg/mL；兔抗V5單克隆抗體（MAb）購自Millipore公司；兔抗GAPDHMAb和鼠抗TRIM74MAb購自Proteintech公司；AlexaFluorTM488兔抗小鼠IgG（H+L）（A21206）購自ThermoFisher公司；Dy?Light800山羊抗鼠IgG和DyLight680山羊抗兔IgG購自KPL公司；Lipofectamine2000轉染試劑、RNAiMax轉染試劑購自Invitrogen公司；5×SDS蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天生物技術有限公司；2×ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix、HiScript?RIIQRTSuperMixforqPCR（+gDNAwiper）購自Vazyme公司；Opti-MEM培養(yǎng)基、10×MEM培養(yǎng)基均購自Gibco公司；F-12K培養(yǎng)基購自WISENT公司；DMEM培養(yǎng)基購自Sigma公司；RNA提取試劑盒購自TIANGEN公司；細胞活力檢測試劑盒CellTiter-Glokit、雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司。1.3引物及siRNA的設計與合成根據NCBI中TRIM74基因序列（378108），設計并合成靶向TRIM74的特異性siRNA以及陰性對照NCsiRNA，序列見表1。根據NCBI中人源IFNB1基因（3456）、ISG56基因（3434）、TRIM74基因（378108）序列，利用PrimerPremier6.0軟件設計合成相應的熒光定量PCR（qPCR）引物及TRIM74擴增引物（表1）。siRNA由上海吉瑪基因公司設計并合成，qPCR引物及克隆引物由吉林庫美生物科技有限公司合成。1.4siRNA干擾TRIM74的表達對流感病毒復制影響的檢測1.4.1TRⅠM74siRNA干擾效率的qPCR檢測將siTRIM74-331和陰性對照NCsiRNA各取30pmol（1.5μL），利用RNAiMAX轉染試劑分別轉染A549細胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)48h后用BufferRZ裂解細胞，收獲細胞樣品并提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA后作為模板，利用表1中的hTRIM74-qPCR引物經qPCR檢測TRIM74的轉錄水平，以GAPDH作為內參校準，以2-ΔΔCt法分析數據結果。表1siRNA及引物序列Table1siRNAandprimerssequences1.4.2siRNA干擾TRⅠM74的表達后對細胞活力影響的檢測按1.4.1中的方法將siTRIM74-331和NCsiR?NA分別轉染A549細胞，并將細胞鋪于透光的96孔細胞培養(yǎng)板內，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)。48h后利用細胞活力檢測試劑盒檢測干擾TRIM74的表達對細胞活力的影響。1.4.3siRNA干擾TRⅠM74的表達后對流感病毒復制影響的噬斑滴定檢測按照1.4.1中的方法將si?TRIM74-331和NCsiRNA分別轉染A549細胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)。48h時，將AIVWSN株以MOI0.01感染細胞，分別于感染后24h、48h收集細胞上清，采用文獻中病毒噬斑滴定方法[13]，檢測干擾TRIM74的表達對流感病毒復制的影響。1.5過表達TRIM74對流感病毒復制影響的檢測1.5.1TRⅠM74過表達細胞系的構建與鑒定提取A549細胞總RNA并反轉錄為cDNA作為模板，利用表1中的TRIM74-pLVX引物對經PCR擴增TRIM74基因，并將其克隆至慢病毒過表達載體pLVX中，構建pLVX-TRIM74質粒。經測序比對鑒定正確后，將pLVX-TRIM74和輔助質粒pASPI2、pMDG2共轉染HEK293T細胞包裝成慢病毒，同時轉染pLVX空載體和輔助質粒作為對照。48h后收集慢病毒侵染A549細胞，12h后補加含10%FBS的F-12K培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48h后再利用流式細胞術分選綠色熒光強度高的細胞，經過多次傳代培養(yǎng)，獲得過表達TRIM74基因的細胞系（A549-pLVX-TRIM74）以及對照細胞（A549-pLVX）[14]。分別提取上述兩種細胞總RNA反轉錄為cDNA后作為模板，經1.4.1中的qPCR鑒定這兩種細胞系；取相同數目的該兩種細胞，經1×SDS蛋白上樣緩沖液裂解后，分別以鼠抗TRIM74MAb（1∶1000）、兔抗GAPDHMAb（1∶1000）作為一抗，DyLight680山羊抗兔IgG（1∶10000）和DyLight800山羊抗鼠IgG（1∶10000）為二抗，經westernblot鑒定這兩種細胞中TRIM74蛋白的表達。1.5.2過表達TRⅠM74對流感病毒復制影響的噬斑滴定檢測將A549-pLVX-TRIM74細胞和對照A549-pLVX細胞分別鋪于12孔板，待細胞密度為80%時，將WSN株以MOI0.01感染細胞，分別于感染后24h、48h收集細胞上清，按照1.4.3的方法進行噬斑滴定，檢測過表達TRIM74對流感病毒復制的影響。1.6流感病毒感染對宿主細胞內源TRIM74mRNA轉錄水平及其蛋白表達影響的檢測1.6.1流感病毒感染對內源TRⅠM74mRNA轉錄水平影響的qPCR檢測將A549細胞和HEK293T細胞分別鋪于12孔板，待細胞長滿單層后，將WSN株以MOI5分別感染上述兩種細胞，分別于感染后0、3h、6h和9h收獲細胞樣品并提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA作為模板，利用表1中的hTRIM74-qP?CR、GAPDH-qPCR引物，經qPCR檢測內源TRIM74mRNA的轉錄水平。1.6.2流感病毒感染對內源TRⅠM74蛋白表達影響的westernblot檢測將WSN株以MOI5分別感染12孔板中長滿單層的A549細胞和HEK293T細胞，設未感染病毒的細胞為陰性對照，37℃培養(yǎng)9h后裂解細胞，按照1.5.1中的westernblot方法檢測上述兩種細胞中內源TRIM74蛋白的表達水平。1.7過表達TRIM74對相應干擾素分泌水平影響的檢測1.7.1過表達TRⅠM74對細胞中ⅠFN-β和ⅠSRE啟動子活性影響的雙熒光素酶試驗將pTRIM74-V5表達質粒以不同劑量（0、50ng、100ng、200ng）分別轉染HEK293T細胞，24h后裂解細胞，取裂解液經SDS電泳后，分別以兔抗V5MAb（1∶1000）、兔抗GAPDHMAb（1∶1000）為一抗，以DyLight680山羊抗兔IgG（1∶10000）為二抗，經westernblot檢測TRIM74的過表達。在確定TRIM74呈劑量依賴性過表達后，將本實驗分為兩組：將上述不同劑量的pTRIM74-V5表達質粒及pCDNA3.1空載體（陰性對照）分別與pRL-TK、pIFN-β-Luc報告質粒共轉染HEK293T細胞（1組）；另一組將上述不同劑量的pTRIM74-V5表達質粒及pCDNA3.1空載體（陰性對照）分別與pRL-TK、pISRE-Luc報告質粒共轉染HEK293T細胞（2組）。37℃培養(yǎng)24h后分別以SeV（MOI1）感染上述各組細胞，感染12h后裂解細胞，10000r/min，室溫離心10min后，取20μL上清加入96孔板，利用GloMax96MicroplateLuminometer生物化學發(fā)光儀檢測各組細胞的雙熒光素酶活性，分析過表達TRIM74對IFN-β和ISRE啟動子活性的影響。所有實驗組至少重復檢測3次。1.7.2過表達TRⅠM74對ⅠFN-β和ⅠSG56mRNA轉錄水平影響的qPCR檢測將pTRIM74-V5表達質粒轉染HEK293T細胞，同時以轉染pCDNA3.1空載體的細胞作為陰性對照，24h后分別采用SeV和poly(I:C)刺激細胞，并分別設未經SeV和poly(I:C)刺激的上述各組細胞作為Mock組。12h后收獲細胞提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA作為模板，采用表1中的引物hIFNB1-qPCR、hISG56-qPCR和GAPDH-qPCR，經qPCR分別檢測各組細胞中IFN-β和ISG56的轉錄水平。1.8干擾TRIM74表達對相應干擾素分泌水平影響的qPCR檢測分別將siTRIM74-331和陰性對照NCsiRNA轉染HEK293T細胞，24h后，分別將pRLTK+pIFN-β-Luc報告質粒和pRL-TK+pISRE-Luc報告質粒轉染上述各組細胞，24h后分別采用SeV和poly(I:C)刺激細胞，并分別設未經SeV和poly(I:C)刺激的上述各組細胞作為Mock組。12h后，采用1.7.2中的qPCR方法分別檢測上述細胞中IFN-β和ISG56mRNA的轉錄水平。1.9數據的統(tǒng)計與分析所有數據均采用GraphPadPrism8.0軟件進行統(tǒng)計學分析，以t檢驗比較各組間的差異。ns表示P＞0.05，差異不顯著；*表示P＜0.05，差異顯著；**表示P＜0.01、***表示P＜0.001、****表示P＜0.0001，差異均極顯著。2結果2.1siRNA干擾TRIM74的表達對流感病毒復制影響的檢測結果將siTRIM74-331與對照NCsiRNA分別轉染A549細胞后，經qPCR檢測siTRIM74-331的干擾效率，并利用細胞活力檢測試劑盒檢測干擾TRIM74的表達對細胞活力的影響。結果顯示，與轉染對照NCsiRNA的細胞相比，轉染siTRIM74-331的A549細胞中TRIM74mRNA的轉錄水平下降了62.70%（P＜0.0001）（圖1A），但不影響細胞活力（P＞0.05）（圖1B），表明siTRIM74-331干擾效果較好，可以用于后續(xù)試驗。將siTRIM74-331與對照NCsiRNA分別轉染A549細胞，48h后用WSN（MOI0.01）感染細胞，分別于感染后24h和48h收獲上清進行噬斑滴定，結果顯示，與轉染NCsiRNA的對照組相比，干擾TRIM74的表達再感染WSN株24h、48h后細胞中的病毒滴度分別下降5.21%和61.19%（P＜0.001）（圖1C），表明下調TRIM74的表達可以抑制流感病毒的復制。圖1siRNA干擾TRIM74的表達對流感病毒復制影響的檢測結果Fig.1TheresultsoftheeffectofsiRNAinterferencewiththeexpressionofTRIM74oninfluenzavirusreplication2.2過表達TRIM74對流感病毒復制影響的檢測結果構建的重組質粒pLVX-TRIM74經測序鑒定正確后與輔助質粒共轉染HEK293T細胞包裝成慢病毒，48h后收獲慢病毒侵染A549細胞，48h后利用流式細胞術分選陽性細胞，多次傳代后，通過qPCR和westernblot鑒定獲得的細胞。結果顯示，該細胞中TRIM74基因的轉錄水平及其蛋白的表達水平較轉染空載體及相應輔助質粒獲得的對照細胞均明顯升高（圖2A、圖2B），表明TRIM74基因過表達細胞A549-pLVX-TRIM74以及對照細胞A549-pLVX均正確構建。將WSN（MOI0.01）分別感染這兩種細胞，感染后24h、48h分別收集上清經病毒的噬斑滴定。結果顯示，A549-pLVX-TRIM74細胞中的病毒滴度分別為9.13×105pfu/mL與2.03×106pfu/mL，對照細胞相應時間的病毒滴度分別為4.73×105pfu/mL與1.07×106pfu/mL，前者相較后者分別上升了1.93倍（P＜0.01）和1.90倍（P＜0.05）（圖2C），表明過表達TRIM74蛋白可以促進流感病毒的復制。圖2過表達TRIM74對流感病毒復制影響的檢測結果Fig.2TheresultsoftheeffectoninfluenzavirusreplicationbyoverexpressionofTRIM742.3流感病毒感染對細胞中內源TRIM74mRNA的轉錄水平及其蛋白表達影響的檢測結果將WSN株（MOI5）分別感染A549細胞和HEK293T細胞后，分別利用qPCR（感染后不同時間）和westernblot（感染后9h）檢測內源TRIM74mRNA的轉錄水平及其蛋白的表達水平。結果顯示，與未感染的對照細胞相比，流感病毒感染后的A549細胞和HEK293T細胞中TRIM74mRNA的轉錄水平隨感染時間的延長而增加（P＜0.001、P＜0.01）（圖3A、圖3C）；其蛋白表達水平也均明顯增加（圖3B、圖3D），表明流感病毒感染會刺激細胞中內源TRIM74蛋白的表達，推測細胞可能通過上調TRIM74蛋白的表達以某種方式響應流感病毒的感染。圖3流感病毒感染對細胞中內源TRIM74的轉錄水平及其蛋白表達影響的檢測結果Fig.3DetectionresultsoftheeffectofinfluenzavirusinfectiononthetranscriptionlevelofendogenousTRIM74anditsproteinexpressionincells2.4過表達TRIM74對干擾素分泌水平影響的檢測結果2.4.1過表達TRⅠM74對細胞中ⅠFN-β和ⅠSRE啟動子活性影響的雙熒光素酶試驗結果將不同劑量的pTRIM74-V5轉染HEK293T細胞，24h后，經westernblot檢測TRIM74的過表達。結果顯示，TRIM74在細胞中的表達量呈劑量依賴性的增加（圖4A）。將上述劑量的pTRIM74-V5與pRL-TK、pIFN-β-Luc共轉染HEK293T細胞（1組）；同時將上述劑量的pTRIM74-V5與pRL-TK、pISRE-Luc共轉染HEK293T細胞（2組）。24h后用SeV（MOI1）感染上述細胞，12h后采用雙熒光素酶試劑盒檢測雙熒光素酶活性，分析過表達TRIM74對IFN-β和ISRE啟動子活性的影響。結果顯示，轉染空載體的對照細胞在感染SeV后IFNβ和ISRE啟動子被顯著激活，而1組和2組細胞中IFN-β和ISRE啟動子的活性均顯著下降（P＜0.0001、P＜0.0001），且隨pTRIM74-V5轉染量的升高二者的活性均呈下降趨勢（圖4B、圖4C）。表明過表達TRIM74能夠抑制SeV誘導的IFN-β和ISRE啟動子的激活作用。圖4過表達TRIM74對IFN-β和ISRE啟動子活性影響的雙熒光素酶試驗結果Fig.4TheresultsoftheeffectonIFN-βandISREpromoteractivitiesdetectedbydual-luciferaseassayinover-expressingTRIM74cells2.4.2過表達TRⅠM74對ⅠFN-β和ⅠSG56轉錄水平影響的qPCR檢測結果將pTRIM74-V5轉染HEK293T細胞，24h后分別采用SeV和poly(I:C)刺激細胞，12h后采用qPCR分別檢測各組細胞中IFN-β和ISG56mRNA的轉錄水平。結果顯示，SeV和poly(I:C)刺激后的各組細胞中IFN-βmRNA的轉錄水平均顯著高于Mock組細胞，且轉染pTRIM74-V5細胞中IFN-β的轉錄水平均極顯著低于轉染空載體的陰性對照細胞（P＜0.01、P＜0.001）（圖5A、圖5B）；各組細胞中ISG56mRNA的轉錄水平與上述結果均一致（P＜0.0001、P＜0.01）（圖5C、圖5D）。上述結果表明，過表達TRIM74能夠抑制相應干擾素基因的轉錄水平。圖5過表達TRIM74對IFN-β和ISG56轉錄水平影響的qPCR檢測結果Fig.5qPCRdetectionsoftheeffectonIFN-βandISG56transcriptionlevelbyover-expressingTRIM742.5干擾TRIM74的表達對IFN-β和ISG56轉錄水平影響的qPCR檢測結果將siTRIM74-331與對照NCsiRNA分別轉染HEK293T細胞，48h后分別采用SeV和poly(I:C)刺激細胞，12h后經qPCR檢測IFN-β和ISG56mRNA的轉錄水平。結果顯示，與Mock組細胞相比，SeV和poly(I:C)刺激后的各組細胞中IFN-β和ISG56的mRNA水平均顯著升高，且轉染siTRIM74-331細胞中IFN-β的轉錄水平均顯著高于轉染空載體的陰性對照細胞（P＜0.0001、P＜0.0001）（圖6A、圖6B）；各組細胞中ISG56mRNA的轉錄水平與上述結果均一致（P＜0.05、P＜0.0001）（圖6C、圖6D），表明下調表達TRIM74顯著促進相應干擾素基因的轉錄水平。結合2.4的結果表明，TRIM74能夠負調控細胞中相應干擾素的分泌水平。圖6siRNA干擾TRIM74的表達對IFN-β和ISG56轉錄水平影響的qPCR檢測結果Fig.6qPCRdetectionsoftheeffectonIFN-βandISG56transcriptionlevelbysilencingtheexpressionofTRIM74withsiRNA3討論流感的控制策略依賴于疫苗接種，但流感病毒亞型眾多、變異迅速，需要及時更新疫苗種毒[15]，且目前的抗病毒藥物如金剛烷胺等也正在失去效力[16]。因此，迫切需要探究AIV新的抗病毒機制，并基于這些機制開發(fā)新的治療藥物。根據流感病毒復制所需的宿主依賴因子（HDF）的特性設計藥物或小分子抑制劑干預HDF的促病毒復制功能，可有效對抗流感病毒并最大限度地減少耐藥病毒株的出現。TRIM家族蛋白含有保守的RING-B-box-coiledcoil結構域，并廣泛參與細胞的生物學過程，且部分TRIM能夠調節(jié)宿主細胞的先天免疫反應，并參與其對病原的識別及免疫信號傳導過程[17]。目前關于TRIM74蛋白尚無相關研究報道，其蛋白功能有待探究。因此，本研究對TRIM74是否參與宿主的抗流感病毒感染及其天然免疫調節(jié)進行了初步探究。本研究采用噬斑滴定試驗證明siRNA干擾TRIM74的表達后能夠抑制流感病毒的復制。由于重組質粒在流感病毒靶細胞A549中的轉染效率低，所以本研究構建了TRIM74蛋白的過表達細胞A549-pLVX-TRIM74和對照細胞A549-pLVX，并進