骨髓間充質(zhì)干細胞輸注對炎癥性腸病的影響

骨髓間充質(zhì)干細胞輸注對炎癥性腸病的影響

0間充質(zhì)干細胞治療炎癥性腸病的優(yōu)勢炎癥性腸病是一組非特異性腸炎，包括潰瘍性胃炎和克羅恩病。炎癥性腸病是消化系統(tǒng)常見疾病之一,多數(shù)患者病情呈長期反復發(fā)作,往往發(fā)展為終身致殘性的慢性疾病,嚴重影響個人生活質(zhì)量甚至危及患者生命,現(xiàn)有的臨床治療方法療效并不令人滿意,迫切需要探索新的有效的治療手段。目前的研究表明,輸注骨髓間充質(zhì)干細胞有望成為臨床治療炎癥性腸病最有前景的方法之一。已知炎癥性腸病的炎癥是一種癌前病變,隨著病程的遷延,發(fā)生癌變的風險逐年增加。因此推測,輸注骨髓間充質(zhì)干細胞在治療炎癥性腸病的過程中,由于控制了炎癥,可能進而減緩或抑制炎癥性腸病炎癥惡性轉(zhuǎn)化的進程。然而,在乳腺癌等腫瘤的研究中顯示間充質(zhì)干細胞可能參與腫瘤間質(zhì)形成、成血管作用及免疫抑制等而促進腫瘤進展。這樣,就提出了一個疑問,間充質(zhì)干細胞在治療炎癥性腸病的同時,究竟是抑制還是促進炎癥性腸病的惡變?這將是決定骨髓間充質(zhì)干細胞能否廣泛應(yīng)用于炎癥性腸病治療的關(guān)鍵。鑒于此,實驗首先通過小鼠實驗性結(jié)腸炎模型來證實間充質(zhì)干細胞治療的有效性,并進一步構(gòu)建小鼠結(jié)腸炎相關(guān)腸癌模型,模擬人體炎癥性腸病炎癥到腫瘤的漫長轉(zhuǎn)化過程,來探討間充質(zhì)干細胞在治療炎癥性腸病中的遠期腫瘤學安全性。1材料和方法隨機對照動物實驗。實驗于2013年3至12月在中山大學實驗動物中心及中山大學胃腸病學研究所完成。動物實驗動物SPF級健康雌性3周齡(n=20)及7周齡(n=40)Balb/c(H-2d)小鼠,購自中山大學實驗動物中心,動物許可證號SCXK(粵)2004-0011,在(22±1)℃恒溫房內(nèi)飼養(yǎng),12h光照和12h避光循環(huán)交替,自由進食和飲水。所有動物實驗方案遵守中山大學實驗動物倫理委員會的有關(guān)規(guī)定。方法抗小鼠免疫表型的制備取3周齡SPF級雌性Balb/c(H-2d)小鼠,參照文獻獲取骨髓細胞,用含體積分數(shù)10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液,置37℃、體積分數(shù)5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后首次換液,去除大量懸浮生長的造血細胞,之后每三四天更換培養(yǎng)液1次,當細胞達到80%以上融合時進行傳代。應(yīng)用FITC標記的抗小鼠CD29,CD45,MHC-Ⅰ,MHC-Ⅱ及PE標記的抗小鼠CD34,CD44,以流式細胞儀鑒定間充質(zhì)干細胞的免疫表型。參考文獻進行成骨、成脂誘導分化實驗以檢測其分化潛能(分別使用茜素紅S和油紅O染色)。取第三、四代骨髓間充質(zhì)干細胞用于后續(xù)實驗。小鼠腸管組織病理學檢測取7周齡SPF級雌性Balb/c(H-2d)小鼠12只,適應(yīng)環(huán)境1周后,參考文獻,給予4%葡聚糖硫酸鈉自由飲用7d,然后隨機等分為間充質(zhì)干細胞組和PBS組。間充質(zhì)干細胞組分別于實驗第2,5,8天經(jīng)尾靜脈注射0.3mL含1×106間充質(zhì)干細胞的PBS細胞懸液,對照組則經(jīng)尾靜脈注射PBS。實驗期間每天定時對實驗動物進行臨床評估,包括體質(zhì)量、大便性狀(黏稠度)、便血指征(大便隱血或肉眼血便)以及飲食、飲水情況。實驗第15天,頸椎脫臼處死動物,切取整段結(jié)腸,分別剪取治療組和對照組小鼠結(jié)腸遠端、中段及近端長度為1cm的腸管組織,40g/L甲醛固定過夜,常規(guī)石蠟包埋,4μm連續(xù)切片。蘇木精-伊紅染色,常規(guī)倒置顯微鏡檢查,明確炎癥反應(yīng)及上皮損害程度分級,并參考文獻進行組織炎癥損傷嚴重度評分。具體評分標準為:①炎癥細胞浸潤程度(0:無明顯炎癥細胞,1:浸潤黏膜固有層,2:浸潤黏膜+黏膜下,3:透壁浸潤)。②黏膜損傷(0:正常形態(tài),1:輕-中度上皮缺損,2:較大范圍上皮缺損,3:隱窩缺損,4:較大范圍隱窩缺損),每張切片的組織評分為2項得分之和。小鼠腸道建議的cm-dii模型體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞貼壁后,以PBS洗滌3次,加入2mg/LCM-DiI工作液,37℃孵育5min,再轉(zhuǎn)至4℃孵育15min,吸除CM-DiI工作液,PBS輕柔洗滌3次,胰酶消化制備3.5×109L-1間充質(zhì)干細胞單細胞懸液。同前制備小鼠實驗性結(jié)腸炎模型,于實驗第8天經(jīng)尾靜脈注射CM-DiI標記的間充質(zhì)干細胞。實驗第15天,處死動物,分別切取結(jié)腸遠端、中段、近端及小腸長度為1cm的腸管,立即置入-80℃保存。冰凍切片,層厚5μm,以Ti-U倒置熒光顯微鏡觀察(熒光激發(fā)波長553nm,發(fā)射波長570nm)。間充質(zhì)干細胞輸注后向炎癥腸道的轉(zhuǎn)化參考文獻構(gòu)建小鼠結(jié)腸炎癌變模型。取7周齡SPF級雌性Balb/c(H-2d)小鼠10只隨機等分為間充質(zhì)干細胞組和PBS組,適應(yīng)環(huán)境1周后,于實驗第1天腹腔注射偶氮氧甲烷10mg/kg,2%葡聚糖硫酸鈉飲水1周后接正常飲水2周為一周期,總共進行3周期。間充質(zhì)干細胞組分別于實驗第1,2,3周末經(jīng)尾靜脈注射0.3mL含1×106間充質(zhì)干細胞的PBS細胞懸液,對照組則經(jīng)尾靜脈注射PBS。實驗結(jié)束后處死小鼠,分離結(jié)腸,觀察小鼠腸道腫瘤形成情況。①葡聚糖硫酸鈉結(jié)腸炎小鼠模型中間充質(zhì)干細胞實驗組及對照組結(jié)腸炎癥病變的病理學改善情況及組織炎癥損傷嚴重度評分。②葡聚糖硫酸鈉結(jié)腸炎小鼠模型中間充質(zhì)干細胞輸注后向炎癥腸道的歸巢分布情況。③葡聚糖硫酸鈉/偶氮氧甲烷結(jié)腸炎癌變小鼠模型中,間充質(zhì)干細胞實驗組及對照組結(jié)腸腫瘤的形成情況。結(jié)果以ue0af±s表示,用SPSS15.0統(tǒng)計軟件包(美國SPSS公司)進行處理。兩組數(shù)據(jù)間采用獨立樣本t檢驗,P<0.05為差異有顯著性意義。2結(jié)果的結(jié)果2.1小鼠巖板中小鼠巖板的急性毒性模型實驗選用40只小鼠,分別構(gòu)建實驗性結(jié)腸炎模型和小鼠結(jié)腸炎癌變模型,并進入分組實驗,所有小鼠無意外死亡,均進入實驗結(jié)果分析階段。2.2流式細胞檢測骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)擴增傳代3代以后,獲得形態(tài)比較均一的梭形細胞,平行排列或旋渦樣單層集落生長,也可見多角形和扁平狀細胞。相差顯微鏡下細胞核漿比大,胞漿少,核大,核仁明顯。應(yīng)用流式細胞檢測顯示,骨髓間充質(zhì)干細胞不表達CD34,CD45和MHCⅡ類分子,高表達CD29,CD44和MHCⅠ類分子。體外經(jīng)成骨誘導培養(yǎng)兩至三周后,大多數(shù)細胞發(fā)生形態(tài)變化,由原來的梭形變?yōu)槎嘟切位虿灰?guī)則形,細胞呈結(jié)節(jié)狀生長,并有鈣鹽沉積,茜素紅S染色證實有骨鈣結(jié)節(jié)形成(圖1A);成脂誘導分化2周后,細胞內(nèi)可見融合成團、被油紅O染成紅色的脂滴(圖1B)。2.3間充質(zhì)干細胞治療小鼠結(jié)腸遠端組織病理學檢測盡管對照組結(jié)腸炎小鼠在停止飲用葡聚糖硫酸鈉后癥狀趨向逐漸好轉(zhuǎn),但治療組小鼠恢復更加明顯,腹瀉、便血明顯好轉(zhuǎn),實驗結(jié)束時體質(zhì)量喪失、糞便黏稠度(不成形黏稠大便)、大便潛血較對照組均有減輕。鏡下,間充質(zhì)干細胞治療組小鼠遠端結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)基本完整,有小范圍上皮缺損或隱窩缺損,黏膜層和黏膜下層較多炎癥細胞浸潤,可見毛細血管和小血管增生。而對照組小鼠遠端結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)較紊亂,有較大范圍上皮缺損或部分隱窩消失,見少量隱窩膿腫,黏膜及黏膜下層有大量炎性細胞浸潤,包括中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞和漿細胞(圖2)。間充質(zhì)干細胞治療組小鼠結(jié)腸遠端組織炎癥損傷嚴重度評分低于對照組(P<0.05;圖3)。2.4胞核無標記標記體外CM-DiI標記間充質(zhì)干細胞,顯示細胞膜和胞漿質(zhì)膜被標上染料,胞核無標記,標記率在90%以上。組織標本冰凍切片可見有CM-DiI標記的間充質(zhì)干細胞向結(jié)腸遠端炎癥病變處歸巢定殖,且主要位于黏膜下層(圖4),同一小鼠結(jié)腸近端及小腸組織內(nèi)未見CM-DiI標記的細胞。2.5小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞輸注前3周經(jīng)尾靜脈輸注前3周經(jīng)尾靜脈系統(tǒng)建立Balb/c(H-2d)小鼠的炎癥性腸病癌變模型,在建模周期的前3周經(jīng)尾靜脈輸注同系小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞3次。建模結(jié)束后觀察腸道腫瘤形成的情況,如圖5,結(jié)果顯示經(jīng)間充質(zhì)干細胞治療的小鼠腸道腫瘤數(shù)量及腫瘤負荷(單只小鼠腫瘤的直徑之和)明顯少于對照組(P<0.05)。3間充質(zhì)干細胞對炎癥性腸病惡變的作用隨著對炎癥性腸病發(fā)病機制的不斷闡明和認識的不斷深入,目前普遍認為炎癥性腸病的發(fā)生是遺傳易感個體,在環(huán)境因素及腸道菌叢的參與下,啟動腸道黏膜免疫及非免疫系統(tǒng),在抗原的持續(xù)刺激和免疫調(diào)節(jié)紊亂持續(xù)存在的情況下,導致炎癥級聯(lián)的放大和局部炎癥遞質(zhì)對組織的損傷。其中,黏膜免疫功能的失調(diào)是炎癥性腸病發(fā)生并呈慢性持續(xù)狀態(tài)的中心環(huán)節(jié)。因此,以炎癥/免疫調(diào)節(jié)為主的生物治療將是炎癥性腸病治療的重要方向。骨髓間充質(zhì)干細胞具有低免疫原性、免疫負性調(diào)節(jié)/抗炎、修復受損組織等多種特性,同時又具有細胞來源廣泛,易于分離、體外培養(yǎng)和擴增等特點,使其在炎癥性腸病的治療方面顯示出了誘人的臨床應(yīng)用前景。Forbes等開展的一項開放、多中心的臨床試驗對同種異體間充質(zhì)干細胞治療難治型克羅恩病(對infliximab或adalimumab難治性,克羅恩病疾病活動指數(shù)>250)的有效性進行了研究,結(jié)果顯示,完成治療的15例患者中,在治療第42天,克羅恩病疾病活動指數(shù)評分平均由370降至203,其中12例有臨床反應(yīng),有8例臨床緩解,7例患者內(nèi)鏡下黏膜損傷得到改善。實驗在小鼠葡聚糖硫酸鈉結(jié)腸炎模型上,證實經(jīng)外周靜脈輸注骨髓間充質(zhì)干細胞能明顯改善葡聚糖硫酸鈉誘導的急性結(jié)腸炎小鼠的癥狀及腸道組織炎癥。已有研究表明,間充質(zhì)干細胞可向炎癥組織歸巢而發(fā)揮作用。作者采用熒光示蹤染料CM-DiI標記體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞,經(jīng)尾靜脈輸入葡聚糖硫酸鈉結(jié)腸炎小鼠體內(nèi),冰凍病理結(jié)果顯示標記的間充質(zhì)干細胞存在于結(jié)腸炎癥病變組織,主要位于黏膜下層,而結(jié)腸近端及小腸未見有標記間充質(zhì)干細胞的歸巢,提示間充質(zhì)干細胞能被招募遷移到腸道炎癥病變部位。炎癥性腸病炎癥是一種癌前病變,可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,約2.7%的炎癥性腸病患者在病程30年內(nèi)發(fā)生癌變,約一半的癌變患者最終因罹患結(jié)直腸癌而死亡。炎癥本身在炎癥性腸病的癌變發(fā)生發(fā)展進程中起著決定性作用,動物及人體研究均提示抗炎治療能降低炎癥性腸病癌變的風險[18,19,20,21,22,23,24,25]。那么,似乎有理由推測,輸注骨髓間充質(zhì)干細胞,不僅僅控制炎癥性腸病炎癥,也可能抑制炎癥性腸病惡性轉(zhuǎn)化的進程。然而,目前在乳腺癌等腫瘤的研究中卻顯示間充質(zhì)干細胞可能會通過免疫抑制、向腫瘤間質(zhì)成分分化、或參與腫瘤微血管的構(gòu)建,形成一個利于腫瘤生長的微環(huán)境;但這些證據(jù)是直接在腫瘤模型上給予間充質(zhì)干細胞后進行實驗而得出的,并不能反映在腫瘤形成的漫長轉(zhuǎn)化進程中,給予間充質(zhì)干細胞對腫瘤形成所起的作用。人類炎癥性腸病的惡變是一個漫長的演變過程,輸注骨髓間充質(zhì)干細胞對炎癥性腸病惡性轉(zhuǎn)化的影響很難直接在人體身上進行研究,勢必需要良好的動物模型來模擬人體內(nèi)炎癥性腸病炎癥到癌變的轉(zhuǎn)化過程。應(yīng)用葡聚糖硫酸鈉聯(lián)合偶氮氧甲烷構(gòu)建的小鼠結(jié)腸炎相關(guān)腸癌模型,周期較短、方法簡便、成瘤率高,能在病理及分子機制方面較好地模擬人類炎癥性腸病炎癥向癌變轉(zhuǎn)化過程的情況。為探討輸注間充質(zhì)干細胞對炎癥性腸病炎癥向腫瘤轉(zhuǎn)化的影響,應(yīng)在結(jié)腸炎誘導之后、腫瘤未發(fā)生之前給予治療劑量的間充質(zhì)干細胞,而不是在形成腫瘤后給予,否則不能反映間充質(zhì)干細胞對炎癥性腸病炎癥惡性轉(zhuǎn)化的作用。作者所在課題組預(yù)實驗,已從大體及組織病理學角度證實在第2個循環(huán)葡聚糖硫酸鈉喂養(yǎng)期間(第4周),動物模型無腸道腫瘤形成的證據(jù),由此確保實驗中輸注間充質(zhì)干細胞是在模型發(fā)生惡變之前。實驗發(fā)現(xiàn),在炎癥階段輸注間充質(zhì)干細胞能明顯抑制炎癥性腸病小鼠腸道腫瘤的形成。實驗結(jié)果提示間充質(zhì)干細胞在治療炎癥性腸病的過程中,不會促進/加速炎癥性腸病的癌變進程。間充質(zhì)干細胞抑制炎癥性腸病的癌變,可能通過控制炎癥反應(yīng)從而達到阻斷炎癥向腫瘤的演變,也可能通過直接的免疫調(diào)節(jié)或其他通路直接阻斷炎癥的惡性轉(zhuǎn)化過程,其具體機制如何,還有待更深入的研究來闡明。綜上所述,實驗通過動物模型驗證了輸注骨髓間充質(zhì)干細胞對炎癥性腸病結(jié)腸炎治療的有效性,并首次證實間充質(zhì)干細胞能抑制而非促進炎癥性腸病的惡性轉(zhuǎn)化,為間充質(zhì)干細胞治療炎癥性腸病的生物安全性及合理應(yīng)用提供了客觀的理論依據(jù)。所有作者共同參與實驗的設(shè)計、實施及評估。何小文、陳澤賢對本文有同等貢獻。文章及內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。實驗過程中對動物的處置符合中山大學實驗動物倫理委員會的有關(guān)規(guī)定及2006年科學技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》。炎癥性腸病-是一組多因素導致的腸道慢性非可控性炎癥,包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病。目前普遍認為炎癥性腸病的發(fā)生是遺傳易感個體,在環(huán)境因素及腸道菌叢的參與下,啟動腸道黏