通心絡(luò)膠囊對(duì)糖尿病小鼠視網(wǎng)膜ickisknf-b通路的影響

通心絡(luò)膠囊對(duì)糖尿病小鼠視網(wǎng)膜ickisknf-b通路的影響

糖尿病性視網(wǎng)膜病變（iii）是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。近年來(lái)，隨著生活水平的提高，發(fā)病率和盲率呈上升趨勢(shì)。然而,對(duì)于該病的治療卻沒有一種理想的藥物。DR的發(fā)病機(jī)制尚不明確,有研究表明核轉(zhuǎn)錄因子(nucleartranscriptionfactor,NF-κB)活化影響著該病的進(jìn)程。通心絡(luò)膠囊為中藥復(fù)方制劑,主要成分為人參、全蝎、水蛭、蟬蛻、土鱉蟲、赤芍、冰片等,已有研究將通心絡(luò)膠囊用于DR的輔助治療,但其相關(guān)機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用自發(fā)性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠模型,觀察通心絡(luò)膠囊低、中、高劑量對(duì)DR的治療作用,并從NF-κB的激活角度探討該藥物可能的機(jī)制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1小鼠體質(zhì)量bbl/6g40只KK/Upj-Ay小鼠,體質(zhì)量30~40g;10只C57BL/6小鼠,體質(zhì)量25~30g;均為SPF級(jí),雄性,12周齡,購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK-(京)2009-0002。1.1.2isk引物pla通心絡(luò)膠囊(購(gòu)自石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司),IKKβ、IKBα、P-IKBα、NF-κB一抗(購(gòu)自英國(guó)Abcam公司),7300熒光定量PCR儀(購(gòu)自美國(guó)ABI公司),凝膠成像分析儀(購(gòu)自美國(guó)Biorad公司)。IKKβ引物:上游:5’-CGTGACGGAGGAT-GAGAGT-3’,下游:5’-CGTTTGTCTTGCTGTCTGA-GA-3’,產(chǎn)物片段155bp;IKBα引物:上游:5’-GGT-GTTTGAATGTATTGCTGG-3’,下游:5’-AGGCT-GTTTGGCTGAGGT-3’,產(chǎn)物片段155bp;NF-κB引物:上游:5’-GCGAGAGAAGCACAGATACCA-3’,下游:5’-GGTCAGCCTCATAGTAGCCAT-3’,產(chǎn)物片段168bp;GAPDH引物:上游:5’-TGCTGAGTAT-GTCGTGGAGTC-3’,下游:5’-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3’,產(chǎn)物片段143bp(上海生工合成)。1.2方法1.2.1模型的配制及給藥劑量及時(shí)間40只KK/Upj-Ay小鼠按血糖值隨機(jī)分為模型組(Model)、通心絡(luò)低(TXL-L,1g·kg-1)、中(TXL-M,2g·kg-1)、高(TXL-H,4g·kg-1)劑量組,C57BL/6小鼠為對(duì)照組(NC)。每組各10只,通心絡(luò)高、中、低劑量組按對(duì)應(yīng)劑量灌胃給藥,對(duì)照組和模型組給予等體積的蒸餾水,均為每天1次,連續(xù)12周。4、8、12周后記錄動(dòng)物體質(zhì)量。1.2.2測(cè)定空腹血糖值實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,禁食12h,眼球取血,血糖儀測(cè)定各組小鼠空腹血糖(fastingbloodglucose,FBG)值。1.2.3eb含量測(cè)定給藥結(jié)束后,每組隨機(jī)取6只小鼠,尾靜脈注射伊文思藍(lán)(evansbluemethod,EB)溶液,按照文獻(xiàn)方法,測(cè)定EB在視網(wǎng)膜的含量。1.2.4傳統(tǒng)he染色冰上常規(guī)分離視網(wǎng)膜組織,將小鼠視網(wǎng)膜組織置于20倍體積的40g·L-1多聚甲醛溶液中固定,從低濃度到高濃度梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,連續(xù)切片,切片厚度0.4μm。依照以下順序脫蠟至水:二甲苯2次、無(wú)水乙醇2次、每次10min;體積分?jǐn)?shù)95%、90%、80%、70%乙醇,每次5min,蒸餾水5min;常規(guī)HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化。1.2.5dnapcr擴(kuò)增分離小鼠眼球視網(wǎng)膜組織,Trizol法提取RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄為cDNA,-20℃保存。Real-TimePCR(qPCR)方法擴(kuò)增,95℃預(yù)變性3min,95℃變性15s,58℃退火20s,72℃延伸30s,40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參照。最終結(jié)果計(jì)為與對(duì)照組進(jìn)行比較后的相對(duì)值,對(duì)照組設(shè)置為1。1.2.6活性藍(lán)透射鏡取視網(wǎng)膜組織,加入組織裂解液,提取總蛋白或核蛋白。以β-actin作為內(nèi)參照,SDS-聚丙烯凝膠電泳,待溴酚藍(lán)距分離膠底部1cm時(shí),停止電泳。依目的蛋白分子量分離條帶,濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙依次放置于夾板內(nèi),4℃、100V電泳轉(zhuǎn)膜1h。4℃封閉液振蕩4h,滴加一抗,振蕩混勻,4℃過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育2h。化學(xué)發(fā)光法顯色,對(duì)條帶進(jìn)行吸光度積分掃描。用目的蛋白吸光度值/內(nèi)參照吸光度值的比值進(jìn)行比較。1.3統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果以u(píng)e0af±s表示,采用SPSS13.0軟件進(jìn)行ANOVA分析和LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1體質(zhì)量及fbg各時(shí)間點(diǎn)各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P=0.00,見表1-表2),給藥組、模型組體質(zhì)量、FBG明顯高于同期對(duì)照組(均為P<0.01),模型組與給藥組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。2.2模型組與通心絡(luò)組eb含量的比較與對(duì)照組比較,模型組EB含量明顯升高(P<0.01),通心絡(luò)組EB含量較模型組明顯下降(均為P<0.05)。通心絡(luò)中、高劑量組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),與低劑量組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均為P<0.05,見表3)。2.3視網(wǎng)膜色素上皮質(zhì)HE染色顯示對(duì)照組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞層次分明,結(jié)構(gòu)清晰;模型組視網(wǎng)膜色素上皮層明顯變薄,細(xì)胞排列紊亂;通心絡(luò)各劑量組細(xì)胞排列較清晰,劑量高組結(jié)構(gòu)更致密,細(xì)胞排列更有序,上皮層細(xì)胞較模型組增厚明顯(圖1)。2.4各組大鼠nf-b蛋白表達(dá)水平的比較模型組IKKβ、IKBαmRNA和蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(均為P<0.01),模型組核NF-κB和P-IKBα蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(均為P<0.01);與模型組比較,通心絡(luò)中、高劑量組IKKβmRNA和蛋白表達(dá)顯著下降(均為P<0.01),各劑量組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);通心絡(luò)組IKBαmRNA表達(dá)均顯著低于模型組(均為P<0.01),低劑量組與中、高劑量組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均為P<0.01),中、高劑量組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);通心絡(luò)中、高劑量組IKBα蛋白、P-IKBα蛋白的表達(dá)較模型組顯著下降(均為P<0.01),通心絡(luò)各劑量組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);通心絡(luò)組核NF-κB蛋白表達(dá)均低于模型組(均為P<0.05),各劑量組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);總NF-κBmRNA和蛋白表達(dá)在各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均為P>0.05,見表4)。3通心絡(luò)膠囊對(duì)dr小鼠視網(wǎng)膜免疫組化的作用本研究采用了自發(fā)性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠作為研究DR的模型,通心絡(luò)膠囊灌胃12周,各劑量組不同程度地降低了視網(wǎng)膜內(nèi)EB含量,改善其病理?yè)p傷,使視網(wǎng)膜各層較模型組排列整齊,從形態(tài)學(xué)上證實(shí)了通心絡(luò)膠囊可延緩糖尿病小鼠DR的出現(xiàn),對(duì)DR的防治有一定作用。通心絡(luò)各劑量組與模型組相比,通心絡(luò)組體質(zhì)量和FBG無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均為P>0.05),故考慮通心絡(luò)膠囊不是通過(guò)降低體質(zhì)量和血糖來(lái)改善DR的。各組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均為P=0.00),說(shuō)明不同劑量對(duì)視網(wǎng)膜的影響是不同的。目前,DR的發(fā)病機(jī)制仍不確切,越來(lái)越多的證據(jù)顯示DR是一種炎性反應(yīng)。NF-κB為重要的核轉(zhuǎn)錄因子之一,通常與IKB形成復(fù)合體,以無(wú)活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中,可被多種因素激活,進(jìn)入細(xì)胞核,與基因上的相應(yīng)序列結(jié)合,調(diào)控炎性因子的表達(dá),如TNF-α、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)系列、急性期反應(yīng)蛋白等。很多研究表明,NF-κB均積極參與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生,故本研究圍繞此展開。NF-κB信號(hào)通路中3個(gè)關(guān)鍵因子依次為IKKβ、IKBα和NF-κB。當(dāng)高糖、缺氧、氧化應(yīng)激、病毒、細(xì)菌等因素刺激細(xì)胞時(shí),可激活I(lǐng)KKs,本實(shí)驗(yàn)也觀察到模型組IKKβ較對(duì)照組有明顯的上升趨勢(shì),IKKβ催化IKBα的N-末端絲氨酸磷酸化,實(shí)驗(yàn)中顯示磷酸化的P-IKBα增加明顯,導(dǎo)致IKBα泛素化并降解,則NF-κB游離,向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,核內(nèi)的NF-κB增多,啟動(dòng)了炎癥反應(yīng)和下游通路。IKKs主要包括IKKα、IKKβ和IKKγ,p50/p65二聚體可被IKKβ活化,RelB/p52二聚體可被IKK-α活化,IKKα、IKKβ的活化可被IKKγ調(diào)節(jié)。NF-κB通常指P50/P65(ReLA)的二聚體。因此,本研究對(duì)NF-κB信號(hào)通路中的IKKβ、IKBα磷酸化和NF-κB的核表達(dá)環(huán)節(jié)進(jìn)行了檢測(cè),顯示模型組IKKβ、IKBαmRNA和蛋白,以及核NF-κB和P-IKBα蛋白表達(dá)均升高,給予不同劑量通心絡(luò)膠囊治療后,能不同程度降低以上因子的表達(dá)。提示通心絡(luò)膠囊能通過(guò)抑制DR小鼠視網(wǎng)膜IKKβ、IKBα的磷酸化和核NF-κB的活化,干預(yù)IKKβ/IKBα/NF-κB信號(hào)通路,從而起到改善并防治DR的作用。NF-κB的活化可引起血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、細(xì)胞間黏附因子(ICAM-1)等異常增多。目前,VEGF是最強(qiáng)的促進(jìn)血管生長(zhǎng)的因子,正常狀態(tài)下,視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、Müller細(xì)胞少