姜黃素類化合物體外抗凝血與抗血栓活性研究

姜黃素類化合物體外抗凝血與抗血栓活性研究

姜黃是一種傳統(tǒng)的活血化瘀、抗高血壓、通經(jīng)止痛的中醫(yī)藥。根據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)的研究，姜黃素類化合物具有調(diào)節(jié)血脂、抗凝、氧化、勇氣、抗癌等功效。但目前對姜黃活血化瘀的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究卻鮮有報(bào)道,僅見姜黃素抑制血小板聚集、增加纖溶活性等研究,且大多數(shù)研究未對姜黃素類化合物中其他成分活性進(jìn)行深入探討。為了較為全面地探尋姜黃活血化瘀的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),本實(shí)驗(yàn)選取姜黃素類化合物中3種主要成分姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素作為研究對象,采用經(jīng)典的體外抗凝血及抗血栓方法,以血漿復(fù)鈣時(shí)間、凝血酶時(shí)間、體外血栓溶解率及全血凝塊溶解率為指標(biāo),考察姜黃素類化合物體外抗凝血與抗血栓的活性,為姜黃活血化瘀功效的深入研究、進(jìn)一步探討姜黃組分體外活性提供參考。1材料表面1.1動(dòng)物新西蘭大耳白兔,雄性,體質(zhì)量2.0~2.5kg,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供,合格證號SCXK(京)2007-0003。1.2對照品,凝血酶、牛纖維素原臨用前配方姜黃素對照品、去甲氧基姜黃素對照品,貴州迪大公司產(chǎn)品,質(zhì)量分?jǐn)?shù)均>98%;雙去甲氧基姜黃素對照品,上海順勃生物工程有限公司產(chǎn)品,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%;凝血酶、牛纖維蛋白原(臨用前配制),均為美國Sigma公司產(chǎn)品;氯化鈉注射液,石家莊四藥有限公司生產(chǎn)。2方法2.1對照品質(zhì)量濃度分別精密稱取姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素對照品10.40、10.12、11.31mg,加5%乙醇溶液稀釋成不同質(zhì)量濃度。2.2抗凝劑室外抗凝劑2.2.1血漿復(fù)鈣時(shí)間檢測家兔耳緣靜脈取血4.5mL,加至含有38g/L枸櫞酸鈉0.5mL的10mL離心管中,混勻,1000r/min離心10min,取上清液備用。另取96孔板1個(gè),實(shí)驗(yàn)組每孔加入混合血漿0.1mL及不同質(zhì)量濃度姜黃素(0.208、0.104、0.052mg/mL)、去甲氧基姜黃素(0.202、0.101、0.051mg/mL)、雙去甲氧基姜黃素(0.226、0.113、0.057mg/mL)各0.1mL,對照組加入混合血漿0.1mL及5%乙醇溶液0.1mL,于37℃溫育1min后分別向每孔加入2.775g/LCaCl2溶液0.1mL,計(jì)時(shí),直到檢測到纖維蛋白絲時(shí)停止計(jì)時(shí),重復(fù)10次,求平均值,即為血漿復(fù)鈣時(shí)間。2.2.2凝固所需時(shí)間檢測按“2.2.1”項(xiàng)的方法制備混合血漿,在96孔板中加入混合血漿和不同質(zhì)量濃度(同“2.2.1”項(xiàng))姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素各0.1mL,37℃溫育3min,再加入已預(yù)溫的1×104U/L凝血酶0.1mL,混勻,記錄血漿凝固所需時(shí)間。以5%乙醇溶液為對照,每組重復(fù)10次,取平均值。2.3抗膽紅素酶2.3.1凝血酶的測定家兔耳緣靜脈采血置試管中,按體積比1∶9加入質(zhì)量濃度為38g/L枸櫞酸鈉溶液,然后依次加入纖維蛋白原溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%)、CaCl2溶液(55.5g/L)和凝血酶溶液(1.0×105U/L),加入量為每毫升血中加入纖維蛋白原溶液20μL、CaC12溶液10μL和凝血酶溶液20μL。混勻,注入到內(nèi)徑為8mm的玻璃試管中,37℃水浴20min后取出血栓,切成5mm的小段,放入裝有不同質(zhì)量濃度(同“2.2.1”項(xiàng))姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和5%乙醇溶液各2mL的試管中,37℃溫育,于0、4、12、24、48h分別測定剩余血栓段的質(zhì)量,計(jì)算血栓溶解率,各藥物重復(fù)測定10次。2.3.2全血凝塊溶解率測定家兔心臟采血20mL置于表面皿中,2h后自然凝固后切成0.3cm3的小塊,用生理鹽水淋洗3遍待用。將不同質(zhì)量濃度(同“2.2.1”項(xiàng))的姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素及5%乙醇溶液各2mL加入不同西林瓶中,每組5小瓶,再向各瓶中隨機(jī)加入2個(gè)血塊,37℃水浴保溫,觀察血塊溶解情況,并分別于0、12、24、48h分別測血塊的質(zhì)量,計(jì)算全血凝塊溶解率。全血凝塊溶解率=(血凝塊初始質(zhì)量-藥物作用后各時(shí)間點(diǎn)血凝塊質(zhì)量)/血凝塊初始質(zhì)量3結(jié)果3.1抗凝劑室外抗凝劑3.1.1氧基姜黃素不同質(zhì)量濃度的姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素均能顯著延長家兔血漿復(fù)鈣時(shí)間,其中去甲氧基姜黃素作用最強(qiáng),且呈量效關(guān)系,而姜黃素與雙去甲氧基姜黃素比較無顯著差異。結(jié)果見表1。3.1.2凝血酶時(shí)間檢測不同質(zhì)量濃度的姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素均能延長凝血酶時(shí)間,作用強(qiáng)度均隨著質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng),其中去甲氧基姜黃素作用最強(qiáng),與姜黃素及雙去甲基姜黃素比較具有顯著差異(P<0.05),而姜黃素與雙去甲氧基姜黃素間無顯著差異。結(jié)果見表1。3.2抗膽紅素酶3.2.1漸呈顆粒,漸呈顆粒隨著給藥時(shí)間的延長,各實(shí)驗(yàn)組血栓溶解率也逐漸增大,血栓變得松散,漸呈顆粒狀。與對照組相比較,除低質(zhì)量濃度的雙去甲氧基姜黃素?zé)o溶栓作用外,其他各試藥均有顯著的溶栓作用,其中去甲氧基姜黃素的溶栓作用最強(qiáng),姜黃素與雙去甲氧基姜黃素的溶栓作用無顯著差異,見表2。3.2.2全血凝塊溶解率與對照組比較,姜黃素類成分在不同時(shí)間點(diǎn)均顯示出較強(qiáng)的溶解全血凝塊的作用,且隨著給藥時(shí)間的延長,全血凝塊溶解率增加,其中去甲氧基姜黃素的作用最強(qiáng),與姜黃素、雙去甲氧基姜黃素比較具有顯著差異(P<0.05)。結(jié)果見表2。4實(shí)驗(yàn)結(jié)果對姜黃素類化合物生物活性的影響本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,姜黃素類化合物具有較好的體外抗凝血及抗血栓作用,為姜黃活血化瘀的藥效物質(zhì)之一,其作用機(jī)制可能與激活纖溶酶有關(guān)。血漿復(fù)鈣時(shí)間、凝血酶時(shí)間、體外溶栓實(shí)驗(yàn)均表明去甲氧基姜黃素的體外抗凝血及抗血栓作用強(qiáng)于姜黃素與雙去甲氧基姜黃素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Chen等、Kiuchi等對姜黃素類化合物抗癌及殺線蟲生物活性研究的報(bào)道相一致,這可能與其不對稱的空間結(jié)構(gòu)相關(guān)。去甲氧基姜黃素的抗凝活性強(qiáng)于姜黃素,提示僅以姜黃素作為姜黃質(zhì)量控制與評價(jià)的指標(biāo)缺乏科學(xué)性,希望該實(shí)驗(yàn)結(jié)果對姜黃藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究中有所借鑒。由于姜黃素類物質(zhì)的水溶性很小(溶解度50μmol/L),為均勻性考慮,本實(shí)驗(yàn)中試藥均先采用無水乙醇溶解,再加水稀釋成含醇5%的溶液,溶液性質(zhì)穩(wěn)定,同時(shí)采用5%