食品生物應(yīng)用技術(shù)第二章 -01節(jié)-基因工程概述及其工具酶

第二章基因工程及其在食品科學中的應(yīng)用基因工程基礎(chǔ)基因工程研究方法基因工程在食品科學中的應(yīng)用第一節(jié)基因工程基礎(chǔ)一、基因工程的定義、意義及研究內(nèi)容

（一）基因工程的定義

geneengineering

geneticengineeringrecombinantDNAtechnique

Molecularcloning（二）基因工程的意義

基因工程是現(xiàn)代生物工程的主體核心技術(shù)?；蚬こ痰淖畲筇攸c是可打破生物種屬界限，進行生物種(屬、科、目、綱、門、界)內(nèi)外基因的重組、遺傳信息的轉(zhuǎn)移。

遺傳病、心腦血管病、糖尿病、癌癥過度肥胖綜合癥、老年癡呆癥、骨質(zhì)疏松癥（三）基因工程的研究內(nèi)容

制備目的基因構(gòu)建重組DNA獲得轉(zhuǎn)化體篩選出重組轉(zhuǎn)化體陽性克隆

篩目的基因在受體生物細胞中高效表達隆

二、基因工程的工具酶基因工程的關(guān)鍵技術(shù)之一就是先將目的基因DNA從供體生物體中分離出來，再與合適載體DNA連接重組等，這些分子操作涉及多種不同的酶。主要包括：限制性內(nèi)切核酸酶DNA甲基化酶、DNA聚合酶依賴于DNA的RNA聚合酶連接酶激酶磷酸酶核酸酶（一）限制性內(nèi)切核酸酶與DNA甲基化酶1、定義restrictionendonuclease：指一類能夠識別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)核苷酸序列的內(nèi)切核酸酶DNAmethylase：是指一類能夠識別DNA特定序列，并在其特定堿基的特定位置上引入甲基而發(fā)生修飾作用的酶2、限制性酶（甲基化酶）的命名和分類(1)限制酶(甲基化酶)的命名其命名主要是參照H．O．Smith和D.Nathans提出的待命名酶的供體微生物的屬名與種名相結(jié)合的原則進行的，具體如下：

①以屬名的第一個字母(大寫)和種名的最前兩個字母(小寫)組成的三字母符號為其基本形式

如：來源于大腸桿菌(Escherichiacoli)的酶用Eco表示；來源于流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)的用Hin表示②當同屬不同種的兩種微生物的種名前兩個字母完全相同時，則來自后一種微生物的酶的符號改用其種名詞頭前綴后第一個字母(小寫)代替上述三字母符號中的最后一個字母

如：來自Haemophilusparainfluenzae(副流感嗜血桿菌)的用Hpa表示，．而來自同一屬的Haemophilusparahaemolyticus(副溶血嗜血桿菌)的則用Hph表示。③當微生物具有特殊名稱時，則將代表該特殊名稱的符號置于上述三字母符號之后

如：來自Haemophilusinfluenzae的Rd株的用Hind表示；來自Haemophilusinfluenzae的Rf型的用Hinf表示。④當不止一種限制酶(甲基化酶)分離純化自同一微生物株系時，則依其被分離的先后順序以羅馬數(shù)字(大寫)置于上述命名符號之后

如：來自Haemophilusaegytius的三種酶分別用HaeI、HaeⅡ和HaeⅢ表示；來自Haemophilusinfluenzae的Rd株的三種酶分別用HindI、HindⅡ和HindⅢ表示。⑤為了區(qū)別起見，在上述命名名稱之前加R．表示限制酶類；在上述命名名稱之前加M．表示甲基化酶類如：來自Haemophilusinfluenzae的Rd株的第三種限制性內(nèi)切核酸酶為R.HindⅢ，其相應(yīng)的DNA甲基化酶則為M.HindⅢ。大鼠生長激素基因轉(zhuǎn)入小鼠(2)限制酶的分類

根據(jù)酶的性質(zhì)，可將限制酶分為三個類型:

I型:三種不同亞基組成；輔助因子為ATP、Mg2+及S-腺苷甲硫氨酸

其切割位點距其識別位點至少1000bp；且切割作用是隨機的

Ⅱ型:兩個相同亞基組成；輔助因子僅為Mg2+；其識別位點常具旋轉(zhuǎn)對稱性；其切割位點與其識別位點重疊或在其附近；且切割作用特異性強

Ⅲ型:兩種不同亞基組成；輔助因子為ATP和Mg2+，也受S-腺苷甲硫氨酸激活，但并非必需；其切割位點一般在距其識別位點3’端24～26bp處

PstI5’-CTGCA↓G-3’3’-G↑ACGTC-5’

HpaI5’-GTT↓AAC-3’3’-CAA↑TTG-5’限制性內(nèi)切酶的旋轉(zhuǎn)對稱性

需要指出的是，I型和Ⅲ型限制性內(nèi)切核酸酶均兼具限制酶活性和甲基化酶活性；而對Ⅱ型限制性內(nèi)切核酸酶而言，其只具限制酶活性，與其相應(yīng)的DNA甲基化酶才具甲基化酶活性。Ⅱ型限制性內(nèi)切核酸酶及其相應(yīng)的DNA甲基化酶對DNA有相同的識別序列。

(3)Ⅱ型限制性內(nèi)切核酸酶的基本特性

①識別序列與切割位點

Ⅱ型限制性內(nèi)切核酸酶可識別長度為4～7bp的雙鏈DNA特定序列，該識別序列(識別位點)常呈旋轉(zhuǎn)對稱性

②切割方式

平齊末端、5’—磷酸端2～5個核苷酸突出單鏈黏性末端、3’-羥基端2～5個核苷酸突出單鏈黏性末端

5′3′3′5′●●●●●●●●●●●●●

5′3′3′5′5′突出——3′突出——

平端——5′3′3′5′Ⅱ型限制性內(nèi)切核酸酶切割方式③同裂酶與同尾酶isoschizomer：在Ⅱ型限制性內(nèi)切核酸酶中，來源不同而識別序列和切割方式均相同者

如：HpaⅡ和MspI兩者的識別序列都是CCGG，切割方式也相同，因此二者為同裂酶

isocaudamer：來源及識別序列不同，但DNA經(jīng)其切割后能形成相同黏性末端者

如：BamHI、BclI、BglⅡ、MboI、Sau3AI及XhoⅡ切割DNA后都形成相同的GATC四核苷酸突出單鏈黏性末端，因此其為一組同尾酶

需要指出的是，由同尾酶切割DNA所得到的黏性末端可以彼此連接起來，但是不能重新切開，即原來同尾酶的識別序列都已不再存在。④限制性片段長度與切割頻率經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶切割后產(chǎn)生的DNA片段稱為限制性片段(restrictionfragment)。一般不同限制酶切割DNA后所形成的限制性片段長度不一

假設(shè)在某DNA分子中，A或T出現(xiàn)的頻率為X，G或C出現(xiàn)的頻率為Y，那么某限制酶在該DNA分子上的切割位點出現(xiàn)頻率(切割頻率或位點頻率)F可用下式表示：

F=XnYm

式中：n——該限制酶識別序列中雙鏈A=T堿基對的數(shù)目；m——該限制酶識別序列中雙鏈G=C堿基對的數(shù)目如果構(gòu)成某DNA分子的堿基對總數(shù)目(B)及某限制酶識別位點核苷酸序列均為已知，那么該限制酶在該DNA分子上的理論切割位點數(shù)目(N)為：

N=BF假定在某DNA分子中四種核苷酸殘基數(shù)量相等，那么識別序列為四個堿基對的限制酶在該DNA分子中切割位點出現(xiàn)頻率為(1／4)4，即1／256，也即平均256個堿基對出現(xiàn)1個切割位點。

同樣，識別序列為六個堿基對的限制酶在該DNA分子中切割位點出現(xiàn)頻率為(1／4)6，即1／4096，也即平均4096個堿基對出現(xiàn)1個切割位點。

需要指出的是：實際情況與理論不相符

(4)影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的主要因素及優(yōu)化策略①底物DNA制備物的純度：蛋白質(zhì)、SDS、EDTA、酚、氯仿、乙醇及高濃度的鹽離子等污染物都會抑制限制酶的活性。②底物DNA的甲基化程度：大腸桿菌的絕大多數(shù)菌株含有兩種DNA甲基化酶：a、dam甲基化酶；b、dcm甲基化酶。③底物DNA的結(jié)構(gòu)構(gòu)型：環(huán)狀雙螺旋DNA較線性DNA穩(wěn)定。因此，在用限制性酶酶解同樣分子量的DNA時，環(huán)狀雙螺旋DNA所需酶量為線性DNA的10~20倍。④酶反應(yīng)緩沖液的組成：

⑤酶反應(yīng)的最適溫度：為了提高限制酶對底物DNA低純度制備物的反應(yīng)效率，一般采用如下方法：a增加限制酶的用量(平均每μg底物DNA可用10IU甚至更多些)；b延長酶催化反應(yīng)的保溫時間，使酶解更完全；c擴大酶催化反應(yīng)的體積，使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌♂?，以減弱其抑制作用；d在反應(yīng)液中加入適量亞精胺(一般應(yīng)用濃度為1～2.5mmol／L)，以利限制酶對基因組DNA的酶解作用。(5)限制性內(nèi)切核酸酶酶解反應(yīng)的操作步驟及注意要點

(二)DNA聚合酶

最常用的依賴于DNA的DNA聚合酶有大腸桿菌DNA聚合酶I(全酶)、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)、T4噬菌體編碼的DNA聚合酶、耐熱的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)等

依賴于RNA的DNA聚合酶，即逆轉(zhuǎn)錄酶，優(yōu)先以RNA為模板，也可以DNA為模板，因此該聚合酶能以RNA為模板催化合成雙鏈DNA1、大腸桿菌DNA聚合酶I(全酶)

來源：大腸桿菌；分子量：109×103的多肽鏈

（1）作用①具有5’→3’DNA聚合酶活性，以單鏈DNA為模板，以帶3’自由羥基的DNA片段為引物；②5’→3’外切核酸酶活性，從5’端既降解雙鏈DNA，也降解RNA-DNA雜交體中的RNA鏈(RNA酶H活性)；③3’→5’外切核酸酶活性，底物為帶3’自由羥基的雙鏈DNA或單鏈DNA。（2）主要用途①以切刻平移法(nicktranslation)標記DNA。在所有聚合酶中，只有該酶能用于此反應(yīng)，因為只有其具有5’→3’外切核酸酶活性。②對DNA分子的3’突出尾進行末端標記。DNA聚合酶Ⅰ2、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)

來源：由大腸桿菌DNA聚合酶I全酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶酶解獲得，也可通過克隆技術(shù)獲得。

分子量：76×103的多肽鏈（1）作用①5’→3’DNA聚合酶活性，以單鏈DNA為模板，以帶3’自由羥基的DNA片段為引物；②3’→5’外切核酸酶活性，底物為帶3’自由羥基的雙鏈DNA或單鏈DNA。（2）主要用途①補平限制酶切割雙鏈DNA所產(chǎn)生的3’凹端；②如果以標記的dNTP補平雙鏈DNA的3’凹端，那么可對DNA分子進行末端標記；③對DNA分子的3’突出尾進行末端標記；④在cDNA克隆中，合成cDNA第二鏈；⑤應(yīng)用Sanger雙脫氧鏈末端終止法進行DNA測序。Klenow酶的作用方式

3、T4噬菌體DNA聚合酶

來源：T4噬菌體感染的大腸桿菌分子量：114×103（1）作用①5’→3’DNA聚合酶活性，以單鏈DNA為模板，以帶3’自由羥基的DNA片段為引物；②3’→5’外切核酸酶活性，底物為帶3’自由羥基的雙鏈DNA或單鏈DNA；（2）主要用途①補平限制酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生的3’凹端；②如果以標記的dNTP補平雙鏈DNA的3’凹端，那么可對DNA分子進行末端標記；③對DNA分子的3’突出尾進行末端標記，并且該酶為利用此法進行此類末端標記的首選酶；④將雙鏈DNA的突出端轉(zhuǎn)化成平齊端。在制備與合成接頭連接的雙鏈DNA時，經(jīng)常利用這一特性。4、TaqDNA聚合酶

來源：水生棲熱菌(Thermusaquaticus)，現(xiàn)可由基因工程途徑來生產(chǎn)

分子量：65×103，是一種非常耐熱的依賴于DNA的DNA聚合酶。（1）作用具有5’→3’DNA聚合酶活性，以單鏈DNA為模板，以帶3’自由羥基的DNA片段為引物。（2）主要用途①對DNA進行測序；②通過聚