11.6 生化實(shí)驗(yàn)報(bào)告 血清γ-球蛋白的分離純化與鑒定及電泳分析

血清γ-球蛋白的分離純化與鑒定及電泳分析

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1、了解蛋白質(zhì)分離提純的總體思路。

2、掌握鹽析法、凝膠層析法和離子交換層析的實(shí)驗(yàn)原理及操作技術(shù)

3、掌握電泳法分離純化蛋白質(zhì)的方法。

【實(shí)驗(yàn)原理】

1、蛋白質(zhì)的粗提——鹽析法

膠體的鹽析是加鹽，鹽中的帶電粒子使蛋白質(zhì)周圍的水化膜減弱，膠粒溶解度降低，形成沉淀析出的過(guò)程，是膠體的聚沉現(xiàn)象的一種。向蛋白質(zhì)溶液中加入某些濃的無(wú)機(jī)鹽[如(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后，可以使蛋白質(zhì)凝聚而從溶液中析出，這種作用就叫做鹽析。鹽析不能使蛋白質(zhì)變性，可以復(fù)原。利用這個(gè)性質(zhì)，可以采用多次鹽析的方法來(lái)分離、提純蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度取決于蛋白質(zhì)分子表面離子周圍的水分子數(shù)目，亦即主要是由蛋白質(zhì)分子外周親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽后，由于中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，致使蛋白質(zhì)分子周圍的水化層減弱乃至消失。同時(shí)，離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，蛋白質(zhì)溶解度更加降低，之蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。由于各種蛋白質(zhì)在不同鹽濃度中的溶解度不同，不同飽和度的鹽溶液沉淀的蛋白質(zhì)不同，從而使之從其他蛋白中分離出來(lái)。簡(jiǎn)單的說(shuō)就是將硫酸銨、硫化鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性因素去除而沉淀。由于清蛋白的親水性比球蛋白大，且清蛋白的分子比球蛋白小，所以清蛋白需要高濃度的鹽溶液才能夠發(fā)生鹽析，低濃度的時(shí)候球蛋白發(fā)生鹽析。鹽析法分離蛋白質(zhì)：各種蛋白質(zhì)的顆粒大小、親水程度、pI不同，鹽析所需的鹽濃度也不一樣。調(diào)節(jié)鹽濃度可使不同的蛋白質(zhì)沉淀，從而達(dá)到分離的目的。常用中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉等。硫酸銨：溫度系數(shù)小，溶解度大，蛋白譜廣，鹽析效果好，不易引起變性?？捎昧蛩?氨水按需要調(diào)節(jié)pH值。本實(shí)驗(yàn)中清蛋白分子小，親水性強(qiáng)，在飽和硫酸銨溶液中可沉淀析出，而球蛋白分子大，親水性弱，在半飽和硫酸銨溶液中即可沉淀析出。因此調(diào)節(jié)鹽濃度可使球蛋白與清蛋白分離。

2、脫鹽——凝膠層析法

凝膠層析又稱分子篩過(guò)濾、排阻層析等。它的突出優(yōu)點(diǎn)是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，不需要有機(jī)溶劑，并且對(duì)分離成分理化性質(zhì)的保持有獨(dú)到之處。對(duì)于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。凝膠層析是按照蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)行分離的技術(shù)，又稱之凝膠過(guò)濾，分子篩層析或排阻層析。

單個(gè)凝膠珠本身象個(gè)"篩子"。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。如果將這樣的凝膠裝入一個(gè)足夠長(zhǎng)的柱子中，作成一個(gè)凝膠柱。當(dāng)含有大小不同的蛋白質(zhì)樣品加到凝膠柱上時(shí)，比凝膠珠平均孔徑小的蛋白質(zhì)就要連續(xù)不斷地穿入珠子的內(nèi)部，這樣的小分子不但其運(yùn)動(dòng)路程長(zhǎng)，而且受到來(lái)自凝膠珠內(nèi)部的阻力也很大，所以越小的蛋白質(zhì)，把它們從柱子上洗脫下來(lái)所花費(fèi)的時(shí)間越長(zhǎng)。凝膠中只有很少的孔徑可接受大的蛋白。因此，大的蛋白質(zhì)直接通過(guò)凝膠珠之間的縫隙首先被洗脫下來(lái)。凝膠過(guò)濾所用的凝膠孔徑大小的選擇主要取決于要純化的蛋白質(zhì)分子量。鹽析后的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行凝膠層析則分子量大的球蛋白先流出，由此可獲得脫鹽的球蛋白溶液。

3、純化——離子交換法

離子交換層析是利用離子交換劑對(duì)各種離子的親和力不同，借以分離混合物中各種離子的一種層析技術(shù)。離子交換層析的固定相是載有大量電荷的離子交換劑，流動(dòng)相是具有一定pH和一定離子強(qiáng)度的電解質(zhì)溶液，當(dāng)混合物溶液中帶有與離子交換劑相反電荷的溶質(zhì)流經(jīng)離子交換劑時(shí)，后者即對(duì)不同溶質(zhì)進(jìn)行選擇性吸附。離子交換劑根據(jù)其所帶電荷的性質(zhì)分為陰離子交換劑和陽(yáng)離子交換劑兩類。陰離子交換劑本身帶有正電荷，可以吸引并結(jié)合混合物中帶負(fù)電荷的物質(zhì)；陽(yáng)離子交換劑本身帶負(fù)電荷，可以吸引并結(jié)合混合物中帶正電荷的物質(zhì)。本次試驗(yàn)采用DEAE-纖維素陰離子交換劑，α1-球蛋白、

α2-球蛋白、

β-球蛋白和γ-球蛋白pI都不同，

α1-球蛋白、

α2-球蛋白、

β-球蛋白pI都小于6，γ-球蛋白為7.3，所以在pH=6.5的洗脫液環(huán)境下，γ-球蛋白帶正電，其他球蛋白帶負(fù)電，因而使γ-球蛋白與其他種類球蛋白分離。凝膠層析脫鹽固定相：SephadexG-25流動(dòng)相：pH6.50.02M醋酸鹽緩沖液。離子交換層析純化γ-球蛋白固定相：DEAE纖維素（陰離子交換劑）流動(dòng)相：pH6.50.02M醋酸鹽緩沖液。濃縮：高分子性質(zhì)：SephadexG-25吸水

4、電泳分析蛋白質(zhì)

血清中各種蛋白質(zhì)都有其特有的等電點(diǎn)，利用pI與pH的關(guān)系，pH>pI，待分離物質(zhì)帶負(fù)電，電泳時(shí)向正極移動(dòng)；pH，待分離物質(zhì)帶正電，電泳時(shí)向負(fù)極移動(dòng)；pH=pI，待分離物質(zhì)不帶電，電泳時(shí)不向正極或者負(fù)極移動(dòng)。在同一條件下，不同蛋白質(zhì)帶電荷有差異，分子量大小也不同，所以泳動(dòng)速度不同。血清中蛋白質(zhì)等電點(diǎn)均低于7，在pH=8.6的緩沖溶液中，都形成負(fù)離子向正極移動(dòng)，血清蛋白質(zhì)可分成五條區(qū)帶。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】

經(jīng)過(guò)電泳分析，與對(duì)照組做對(duì)比可以明顯觀察到血清蛋白（清蛋白、

α1-球蛋白、

α2-球蛋白、

β-球蛋白和γ-球蛋白）的五條帶左側(cè)為全血清對(duì)照，右側(cè)為我們組提取的蛋白質(zhì)電泳結(jié)果。

【實(shí)驗(yàn)分析】?jī)?yōu)點(diǎn)

1提取的γ蛋白較為成功，純度較高，基本沒(méi)有肉眼可見到的其他帶的蛋白（與左側(cè)的對(duì)照組相比較可知）。2.在進(jìn)行層析操作時(shí)，嚴(yán)格進(jìn)行轉(zhuǎn)圈滴加，使得液面保持一個(gè)水平狀態(tài)，保證液體留下時(shí)經(jīng)過(guò)相同的距離。3.硫酸銨在進(jìn)行滴加時(shí)，嚴(yán)格按照邊搖邊逐滴加入。4.層析柱的上液層未干涸，保證時(shí)刻有液體。5.離子交換柱使用完后先用醋酸鹽緩沖液洗兩個(gè)柱長(zhǎng)，再用DEAE再生液洗兩個(gè)柱長(zhǎng)，最后再用醋酸鹽緩沖液平衡兩個(gè)柱長(zhǎng)。方便后邊的同學(xué)使用。6.凝膠柱使用完畢后用洗脫液流洗3～4個(gè)柱長(zhǎng)，保持上層有2cm以上的液體，關(guān)閉下方控制夾。方便后邊的同學(xué)使用。7.G-25干膠用紙條少量多次加入，液層高約0.5ml，離心后，管內(nèi)凝膠倒入燒杯回收。8.洗脫液收集無(wú)需分步，用載玻片檢測(cè)蛋白，約每5滴檢測(cè)一次，從開始出現(xiàn)白色懸濁液時(shí)開始收集，直至剛好不在出現(xiàn)白色懸濁液沉淀為止，所收集到的即為試驗(yàn)所需的蛋白質(zhì)，本次試驗(yàn)不用納氏試劑。9.滴加試劑等操作準(zhǔn)確規(guī)范。不足1.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中險(xiǎn)些出現(xiàn)層析柱的上液層干涸現(xiàn)象，應(yīng)時(shí)刻觀察。2.收集蛋白因?yàn)橐暰€受阻，時(shí)很難做到1ml一換管。另外層析速度過(guò)快，導(dǎo)致了收集過(guò)慢的現(xiàn)象，造成了收集的蛋白質(zhì)較少。后來(lái)我們又對(duì)廢液進(jìn)行二次層析，造成蛋白純度偏度。但從結(jié)果來(lái)看影響不是很大。以后層析時(shí)應(yīng)密切注意控制層析速度，3.做完凝膠層析后，其下方螺旋夾損壞。雖修復(fù)，但可能影響層析柱。4.我們組在進(jìn)行離子交換層析時(shí)，發(fā)現(xiàn)濾過(guò)速度過(guò)慢，即使夾子開到最大，液體流出的速度仍舊很慢。本可以采用外加壓力的方法進(jìn)行層析——即在層析上邊用洗耳球外加氣體壓力使層析速度加快。此時(shí)注意的問(wèn)題是不要在拿出洗耳球前松開洗耳球，否則由于洗耳球的吸力可能會(huì)將整個(gè)層析柱內(nèi)的物質(zhì)吸起來(lái)，嚴(yán)重影響層析的結(jié)果。5.