溫度、光照強(qiáng)度和ph對(duì)4株雨生紅球藻光合作用和生長(zhǎng)繁殖速率的影響

溫度、光照強(qiáng)度和ph對(duì)4株雨生紅球藻光合作用和生長(zhǎng)繁殖速率的影響

雨生紅球藻（cysts）的厚壁酪氨酸（cysts）可獲得大量經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的紅色素（astack）（grungetal.1992；李子，1991）。蝦青素在珍稀水產(chǎn)品[主要是鮭鱒魚(yú)類(lèi)(Salmons)]養(yǎng)殖中被廣泛用作餌料添加劑,不僅具有很好的著色效果,可以改善產(chǎn)品的色澤和品質(zhì),而且能增強(qiáng)水產(chǎn)品對(duì)疾病的抵抗力(Toddetal,2000;Benemann,1992;Fossetal,1984;Kranzfelder,1994)。蝦青素的抗氧化能力強(qiáng)于β-胡蘿卜素和維生素E(Tero,1989;Miki,1991),被稱為“超級(jí)維生素”,具有潛在的醫(yī)用價(jià)值。利用雨生紅球藻大量生產(chǎn)蝦青素已成為國(guó)際上微藻生物技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)雨生紅球藻的研究主要集中在兩個(gè)方面:(1)環(huán)境條件對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)繁殖的影響;(2)環(huán)境條件對(duì)雨生紅球藻孢子積累蝦青素的影響,以及人工誘導(dǎo)蝦青素的方法。在環(huán)境條件對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)繁殖的影響方面,各項(xiàng)研究在取得共識(shí)的同時(shí)也存在較大的分歧。溫度、光照、pH是影響微藻生長(zhǎng)繁殖、生物量積累以及次生物質(zhì)代謝的重要條件(王正方等,2001;顏天等,2002;劉建國(guó)等,2002)。關(guān)于最適溫度,Harker等(1995)報(bào)道雨生紅球藻的最適溫度為14—15℃;Lu等(1994)認(rèn)為最適溫度為25—28℃,當(dāng)環(huán)境溫度高于28℃則其生長(zhǎng)受到抑制;Borowitzka等(1991)認(rèn)為其生長(zhǎng)溫度不能超過(guò)28℃,否則會(huì)促進(jìn)膠群體細(xì)胞和靜孢子形成;而張京浦等(1997)研究認(rèn)為溫度在33℃左右為宜。殷明焱等(1998)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明20℃左右生長(zhǎng)比較好,超過(guò)28℃細(xì)胞由游動(dòng)變?yōu)椴粍?dòng)。關(guān)于最適光強(qiáng),Boussiba等(1992)認(rèn)為有利于其生長(zhǎng)的光強(qiáng)為85—120μmol/(m2·s),最適光強(qiáng)為85μmol/(m2·s),當(dāng)光強(qiáng)升到170μmol/(m2·s)時(shí)會(huì)有大量蝦青素積累;Lu等(1994)認(rèn)為雨生紅球藻的飽和光強(qiáng)為90μmol/(m2·s),光強(qiáng)超過(guò)130μmol/(m2·s)則強(qiáng)烈抑制雨生紅球藻的生長(zhǎng);Harker等(1995)認(rèn)為適合生長(zhǎng)的光強(qiáng)范圍為50—60μmol/(m2·s),而對(duì)于蝦青素積累的最適光強(qiáng)為1600μmol/(m2·s)。后來(lái)Harker等(1996)又進(jìn)一步研究表明低光強(qiáng)下[<37μmol/(m2·s)]雨生紅球藻細(xì)胞的成活率相當(dāng)高,并且也能獲得高的生物量。金傳蔭等(1996)認(rèn)為60μmol/(m2·s)的光強(qiáng)接近最適光強(qiáng),但張京浦等(1997)認(rèn)為光強(qiáng)控制在160—320μmol/(m2·s)對(duì)其生長(zhǎng)有利。作者以4株雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)為材料,研究溫度、光照強(qiáng)度和pH對(duì)其光合作用和生長(zhǎng)繁殖速率的影響,以期一方面了解它們的最適溫度、最適光強(qiáng)和最適pH,加深對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)繁殖與環(huán)境條件的關(guān)系的認(rèn)識(shí);另一方面通過(guò)比較4株雨生紅球藻光合作用特性以及對(duì)培養(yǎng)溫度適應(yīng)性,為篩選適合于大量培養(yǎng)生產(chǎn)蝦青素的藻種以及大規(guī)模培養(yǎng)條件的優(yōu)化提供依據(jù)。1材料和方法1.1酶活劑Haematococcuspluvialis26、Haematococcuspluvialis30、Haematococcuspluvialis34和HaematococcuspluvialisWZ由中國(guó)科學(xué)院武漢植物研究所經(jīng)濟(jì)微藻藻種庫(kù)提供。1.2培養(yǎng)基培養(yǎng)基為改良的BG11培養(yǎng)基。1.3繁殖條件4株雨生紅球藻藻種長(zhǎng)期保存在溫度為(22±1)℃、光照強(qiáng)度為50μmol/(m2·s)的環(huán)境中,生長(zhǎng)良好。1.4海藻溶液ph值的測(cè)量采用便攜式pHB-4型pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)測(cè)定藻液的pH值。1.5海藻溶液od值的測(cè)定采用722型可見(jiàn)光分光計(jì)(上海第二分析儀器廠)在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定藻液的OD值,比色杯光徑為1cm。1.6光明強(qiáng)度的測(cè)量用LX-1332型照度計(jì)(日本三菱儀表)測(cè)定。1.7光合放氧速率法lbc采用本實(shí)驗(yàn)室組裝的溶解氧測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定藻液的凈光合速率。系統(tǒng)由具有溫度自動(dòng)補(bǔ)償功能的RSS5100型便攜式溶解氧測(cè)定儀(上海雷磁儀器廠)、帶夾層的玻璃反應(yīng)杯、磁力攪拌器、LKB2219multitempⅡ恒溫循環(huán)水浴(瑞典LKB)和6組熒光冷光源組成。光照強(qiáng)度調(diào)節(jié)范圍為0—800μmol/(m2·s);藻液在磁力攪拌器的作用下持續(xù)運(yùn)動(dòng);直接讀取每分鐘溶解氧的變化值(mg/L),計(jì)算藻的凈光合放氧速率。測(cè)定光合放氧速率,通常采用μmolO2/(mgChl-a·h)為單位。本項(xiàng)研究的目的除了研究溫度、光照強(qiáng)度和pH對(duì)4株雨生紅球藻光合作用的影響,了解它們的最適溫度、光飽和點(diǎn)和最適pH外,還要比較4株雨生紅球藻在各自最適條件下的光合作用速率,為藻種篩選提供依據(jù)。由于4株雨生紅球藻的Chl-a占鮮重的比例差異非常大,為了進(jìn)行相互比較,沒(méi)有采用μmolO2/(mgChl-a·h)為單位,而是以藻的鮮重為基礎(chǔ)計(jì)算光合作用速率,單位采用μmolO2/[mg(FW)·h],更能反映藻細(xì)胞光合作用的能力。1.8棄清液上清液法吸取一定體積的藻液,以4000r/min離心5min,棄去上清液。收集藻泥,先在55℃條件下烘干2h,再在105℃條件下烘干至恒重,精確稱量,計(jì)算每升藻液中藻的干重,按鮮藻含水量90%換算每升藻液中藻的鮮重。1.9光合速率測(cè)定離心收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻,將藻液濃度調(diào)為OD540=0.3,在光照強(qiáng)度為100μmol/(m2·s)條件下,測(cè)定溫度為5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃時(shí)的單位時(shí)間內(nèi)藻液溶解氧濃度的變化,計(jì)算凈光合速率,繪制光合速率隨溫度變化的曲線。凈光合速率{μmolO2/[mg(FW)·h]}=[ΔDO(mg/L)×1000]/[32×FW(mg/L)×t(h)]1.10光合速率測(cè)定離心收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻,將藻液濃度調(diào)為OD540=0.3,在其最適溫度下,測(cè)定光照強(qiáng)度為60、100、150、200、250、300、400、600、800μmol/(m2·s)時(shí)單位時(shí)間內(nèi)藻液溶解氧濃度的變化,計(jì)算凈光合速率,繪制光合速率隨光強(qiáng)變化的曲線,計(jì)算公式見(jiàn)1.9。1.11光合速率的測(cè)定離心收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻,將藻液濃度調(diào)為OD540=0.3,將藻液的pH值分別調(diào)為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0,在黑暗中放置12h,然后在最適光照強(qiáng)度和最適溫度條件下,測(cè)定各個(gè)pH值時(shí)單位時(shí)間內(nèi)藻液溶解氧濃度的變化,計(jì)算凈光合速率,繪制光合速率隨pH變化的曲線,計(jì)算公式見(jiàn)1.9。1.12溫度對(duì)藻液生長(zhǎng)的影響以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的紅球藻為藻種重新接種,藻液密度為(0.5—1.0)×104個(gè)/ml,50ml的三角瓶放25ml藻液,每組二個(gè)重復(fù),置于搖床上,搖床轉(zhuǎn)速為100r/min,連續(xù)光照,光照強(qiáng)度100μmol/(m2·s),溫度根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求分別設(shè)定為10℃、15℃、20℃、25℃、28℃。共培養(yǎng)5天,根據(jù)下列公式計(jì)算生長(zhǎng)速率(μ):μ=(lnN2?lnN1)/(T2?T1)μ=(lnΝ2-lnΝ1)/(Τ2-Τ1)1.13光照強(qiáng)度和光照周期以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的紅球藻為藻種重新接種,接種密度為5.5×104/ml,50ml三角瓶裝25ml藻液,分為兩組,一組連續(xù)光照,光照強(qiáng)度為50μmol/(m2·s),另一組光暗周期為L(zhǎng)∶D=12h∶12h。每隔24h取樣記數(shù),繪制生長(zhǎng)曲線,計(jì)算生長(zhǎng)速率,計(jì)算公式與1.12相同。2結(jié)果2.1光合放氧速率結(jié)果如表1所示。在實(shí)驗(yàn)條件下,H.pluvialis26在5℃時(shí)光合放氧速率低,當(dāng)溫度升高到15℃時(shí),光合放氧速率達(dá)到最大值;在10—20℃范圍內(nèi),光合放氧速率基本保持穩(wěn)定;溫度超過(guò)20℃,光合放氧速率直線下降,35℃時(shí),光合放氧速率只有最大值的1/5。H.pluvialis30的光合放氧速率變化與H.pluvialis26的基本相同,隨著溫度的升高,經(jīng)歷了一個(gè)直線上升—基本穩(wěn)定—直線下降的過(guò)程,20℃時(shí),光合放氧速率最大;35℃時(shí),光合放氧速率只有最大值的1/4。H.pluvialis34在5—15℃范圍內(nèi),光合放氧速率直線上升,15℃時(shí)達(dá)到最大值;15—35℃范圍內(nèi),光合放氧速率直線下降,35℃時(shí),光合放氧速率已成為負(fù)值。H.pluvialisWZ的光合放氧速率變化與H.pluvialis34的很相似,但是其光合放氧速率的最大值出現(xiàn)在10℃時(shí),比其他3個(gè)藻種的溫度都低。2.2光飽和水溶液比結(jié)果如表2所示。在實(shí)驗(yàn)條件下,4株雨生紅球藻的光合放氧速率隨光照強(qiáng)度變化具有非常相似的特征:在低光強(qiáng)時(shí),光合放氧速率隨光照強(qiáng)度的增大而直線上升,當(dāng)光強(qiáng)達(dá)到光飽和點(diǎn),光合放氧速率達(dá)到最大值,光強(qiáng)超過(guò)光飽和點(diǎn),光合放氧速率不再隨光照強(qiáng)度的增大而上升,而是基本保持穩(wěn)定。H.pluvialis26的光飽和點(diǎn)最高,為250μmol/(m2·s);H.pluvialis30和H.pluvialis34的光飽和點(diǎn)均為200μmol/(m2·s);H.pluvialisWZ的光飽和點(diǎn)最低,為150μmol/(m2·s)。2.3光合放氧速率隨時(shí)間的變化如表3所示,在實(shí)驗(yàn)條件下,4株雨生紅球藻的光合放氧速率隨pH變化分為兩種類(lèi)型:(1)隨著藻液pH值的上升,光合放氧速率經(jīng)歷了一個(gè)上升—最大值—下降的過(guò)程;(2)隨著藻液pH值的上升,光合放氧速率持續(xù)下降。H.pluvialis26、H.pluvialis30和H.pluvialis34屬于第一種類(lèi)型,H.pluvialisWZ屬于第二種類(lèi)型。H.pluvialis26、H.pluvialis30和H.pluvialis34的最適pH值分別為8.0、8.0和7.0,H.pluvialisWZ的最大光合放氧速率出現(xiàn)在pH6.0處。當(dāng)pH值達(dá)到12時(shí),4株雨生紅球藻的光合放氧速率均降為負(fù)值。2.4培養(yǎng)生長(zhǎng)速率H.pluvialis26、H.pluvialis30、H.pluvialis34和H.pluvialisWZ在不同溫度下培養(yǎng)的生長(zhǎng)速率見(jiàn)表4,它們分別在20℃、25℃、20℃、15℃時(shí)生長(zhǎng)繁殖最快。2.5胞密度和計(jì)數(shù)光暗周期對(duì)4株雨生紅球藻生長(zhǎng)繁殖速率具有相似的影響。H.pluvialisWZ在連續(xù)光照和12h光照12h黑暗條件下培養(yǎng),細(xì)胞密度的變化見(jiàn)表5。H.pluvialisWZ在連續(xù)光照和12h∶12h光暗周期的條件下培養(yǎng),細(xì)胞數(shù)目的變化有顯著差異。經(jīng)過(guò)4天的培養(yǎng),在連續(xù)光照下,每毫升藻液中的細(xì)胞數(shù)目增加了11.6×104;而在12h∶12h光暗周期條件下,每毫升藻液中的細(xì)胞數(shù)目?jī)H增加了5.0×104,前者的增加量是后者的2倍多;對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)速率(μ)分別為0.284和0.162,前者是后者的1.75倍。3討論3.1適應(yīng)低溫的品系實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,溫度、光照、pH對(duì)雨生紅球藻光合作用有顯著的影響,不同的藻種(品系),光合作用的最適溫度、最適光強(qiáng)和最適pH不同。本實(shí)驗(yàn)中所用的4個(gè)品系,H.pluvialis26、H.pluvialis30和H.pluvialis34的光合作用特性比較相似,而H.pluvialisWZ則顯著不同。H.pluvialis26、H.pluvialis30和H.pluvialis34在10—20℃范圍內(nèi),都表現(xiàn)出活躍的光合作用,屬于適應(yīng)低溫的品系。H.pluvialisWZ的最適溫度為10℃,溫度超過(guò)10℃,光合放氧速率隨溫度的升高而幾乎直線下降,表現(xiàn)出對(duì)低溫特異的適應(yīng)性,與迄今為止所報(bào)道的雨生紅球藻都不同。H.pluvialis26、H.pluvialis30和H.pluvialis34的最適pH為中性和弱堿性,與其他研究者的報(bào)道相同(邱保勝等,1999;Elliott,1934)。而H.pluvialisWZ的最適pH為弱酸性和中性,也是比較特殊的。除了光飽和點(diǎn)不同外,實(shí)驗(yàn)所用的4個(gè)品系的光合放氧速率隨光照強(qiáng)度的變化具有基本相似的特征,值得注意的是,雖然4個(gè)品系的光飽和點(diǎn)都不高,但是,光強(qiáng)升高到光飽和點(diǎn)的4—5倍,光合放氧速率并沒(méi)有下降,即沒(méi)有出現(xiàn)高光抑制現(xiàn)象。根據(jù)這一點(diǎn),作者推論,雨生紅球藻并不像普遍認(rèn)為的那樣對(duì)高光敏感(劉建國(guó)等,2000),實(shí)際上具有較強(qiáng)的耐高光能力。3.2測(cè)定適合于不同品系的最適培養(yǎng)溫度雨生紅球藻生長(zhǎng)繁殖速率隨培養(yǎng)溫度升高的變化與光合作用隨溫度的變化具有相同的趨勢(shì),都經(jīng)歷了上升—最大—下降的過(guò)程。光合作用的最適溫度低的品系,培養(yǎng)的最適溫度也低,反之亦然。有意思的是,4個(gè)雨生紅球藻品系的最適培養(yǎng)溫度都比其光合作用的最適溫度高5℃?，F(xiàn)在還不清楚這一現(xiàn)象只是所研究的4個(gè)品系的巧合,還是雨生紅球藻的特性。從理論上分析,同一藻種(品系)的最適培養(yǎng)溫度與光合作用的最適溫度密切相關(guān),光合作用表現(xiàn)出的溫度適應(yīng)性反映生長(zhǎng)繁殖對(duì)溫度的要求。所以,可以通過(guò)測(cè)定適合于光合作用的溫度來(lái)了解藻種(品系)適合的培養(yǎng)溫度。測(cè)定光合作用速率隨溫度的變化,方法簡(jiǎn)便、省時(shí)、省力,可以快速地對(duì)大量樣品進(jìn)行檢測(cè)。這一方法已經(jīng)在作者的實(shí)驗(yàn)室中成功地用于高溫和低溫螺旋藻品系的篩選。細(xì)胞數(shù)目的增加與光照時(shí)間成正比,表明雨生紅球藻不需要光暗周期變化。在培養(yǎng)中,為了使藻快速生長(zhǎng)繁殖,大量積累生物量,增加光照時(shí)間是有效的手段。3.3有潛力的耐低溫藻種的篩選篩選適合于大量培養(yǎng)的雨生紅球藻,首先應(yīng)該選光合放氧速率高,生長(zhǎng)繁殖快的藻種。比較4個(gè)品系在各自的最適條件下的光合放氧速率和在不同溫度下培養(yǎng)的生長(zhǎng)速率,除H.pluvialis34外,其余三個(gè)品系的表現(xiàn)都較好,并且各有特色。H.pluvialis34的光合放氧速率較低,特別是表1反映出其溫度適應(yīng)范圍很窄,10℃時(shí)出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng),僅在15℃和20℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)較快,溫度超過(guò)25℃,生長(zhǎng)速率明顯下降,不適合作為大量培養(yǎng)的藻種。H.pluvialis26的適應(yīng)范圍最廣,綜合表現(xiàn)最好,是一個(gè)有潛力的藻種。H.pluvialisWZ是一個(gè)特性鮮明的藻種,從其光合作用隨溫度變化的特性看,是一個(gè)特別適應(yīng)于低溫的藻種。由于雨生紅球藻普遍適應(yīng)于較低的培養(yǎng)溫度,最適溫度一般在20℃左右,為了進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn),篩選藻種的注意力一