雙足并趾畸形患兒的先天性并指及相關(guān)基因的分析

雙足并趾畸形患兒的先天性并指及相關(guān)基因的分析

指以異常足部發(fā)育為主要癥狀的遺傳疾病，為常染色體顯性遺傳。臨床上可分為五種類型：、、、和。其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型先天性并指分別定位于2q34~36、2q31~q32和6q21~23.2。并指伴多指(synpolydactyly;SPD)為Ⅱ型并指(syndactyly,typeⅡ),通常情況下多為第3、4手指和第4、5腳趾受累,兩指(趾)間由蹼相連接,不能分離。本病與其他亞型并指(趾)的不同之處在于,可出現(xiàn)多指(趾)。膚紋檢查可見手掌紋理異常,掌褶線斷裂。目前認(rèn)為本病致病基因為HOXD13,定位于2q31-q32。在本研究中,我們對湖南懷化地區(qū)一出生后即發(fā)現(xiàn)雙手并指,雙足并趾畸形患兒的常染色體顯性遺傳先天性并指多指家系進(jìn)行了連鎖分析,表明其與Ⅱ型并指基因所在的區(qū)域緊密連鎖,對HOXD13基因序列分析未發(fā)現(xiàn)突變。1材料和方法1.1病例對照及分析病例來源、家系情況病例由湖南省懷化地區(qū)衛(wèi)生學(xué)校提供,為一先天性并指多指家系。該病已在家系中傳遞了4代,先證者曾祖母為首發(fā)病例。我們對該家系中的42名成員進(jìn)行了分析,其遺傳關(guān)系經(jīng)親屬確證,調(diào)查前每位成員都做到了知情同意。1.2提取的dna用酚-氯仿法從外周全血抽提基因組DNA。1.3連通性分析1.3.1溫度和時間對聚合酶活性的影響5μl反應(yīng)體系,含50ng模板DNA,2.5mol/LMgCl2,10mmol/LTris-HCl(pH8.3),50mmol/LKCl,每種dNTP250mmol/L,每引物0.625pmol/L,和0.25UHotstarTaqDNA聚合酶(QIANGENGmbH,Hilden,Germany)。反應(yīng)采用Perkin-Elmer9700熱循環(huán)儀。采用標(biāo)準(zhǔn)Touchdown程序:95℃預(yù)變性12min;touchdown循環(huán)14次,95℃變性30s,復(fù)性溫度由63℃起始,以后每個循環(huán)遞減0.5℃,直到56℃,72℃延伸90s;之后保持復(fù)性溫度為56℃,1min,再進(jìn)行30個循環(huán);最后產(chǎn)物72℃延伸10min。1.3.2雙核苷酸微衛(wèi)星標(biāo)記ABI公司連鎖圖譜2.0版。本套熒光標(biāo)記物為400個從Ge′ne′thon人類遺傳圖譜中選擇的多態(tài)性雙核苷酸微衛(wèi)星標(biāo)記。每對標(biāo)記物間距為10cM。1.3.3胺凝膠電泳用ABI377DNA測序儀進(jìn)行5%聚丙烯酰胺凝膠電泳,連鎖分析應(yīng)用LINKAGE軟件(Version5.10),外顯率95%,疾病基因頻率設(shè)為0.001。男女兩性重組率相等。1.4突變檢測1.4.1寡核苷酸體外擴(kuò)增作為摸板的基因組DNA來自Ⅱ-10及Ⅲ-16和兩名正常對照Ⅲ-14、Ⅲ-15。使用5對合成的寡核苷酸引物,對目的基因的兩個外顯子及其相鄰內(nèi)含子序列進(jìn)行體外擴(kuò)增?？偡磻?yīng)體積為35μl,采用標(biāo)準(zhǔn)Touchdown程序(同上)。1.4.2pcr產(chǎn)物的測量序列PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,用ABIBig-DyeVer2.0試劑盒進(jìn)行循環(huán)測序反應(yīng),利用ABI377型DNA測序儀分析。2雙側(cè)對稱畸形家系中有16名成員患病。先證者Ⅳ-5,女,2歲?；純撼錾蠹窗l(fā)現(xiàn)雙手并指,雙足并趾畸形。X線顯示雙手3/4指并指,雙足4/5趾并趾,指(趾)間由軟組織相連。并指均呈雙側(cè)對稱畸形。部分患者同時出現(xiàn)雙手4/5指并指,或雙足小趾多趾(圖1)。兩點連鎖分析在Ⅱ型并指基因座2q31~q32發(fā)現(xiàn)緊密連鎖(表1)。在D2s2314和D2s2310兩引物處最大兩點間LOD值為6.78。多點連鎖分析最大LOD值為7.02。本家系單倍型分析遺傳區(qū)間從D2s2302到D2s315之間,間距為20.61cM(圖2)。HOXD13基因位于連鎖區(qū)間之內(nèi)。序列分析在HOXD13基因編碼區(qū)、內(nèi)含子-外顯子交界區(qū)域,或啟動子區(qū)域未發(fā)現(xiàn)突變。3hoxd基因重組并指伴多指(Synpolydactyly;SPD)是一種罕見的常染色體顯性致病基因引起的肢體發(fā)育異常。該型并指(趾)畸形表現(xiàn)為手部3、4指的并指,通常伴蹼中第4指的全部或部分多指畸形,足部第4、5趾并趾及第5趾的多趾畸形。臨床上有手部畸形的患者常伴有異常的掌紋。1927年,Thomsen對本病進(jìn)行了詳細(xì)的描述,隨后相繼發(fā)現(xiàn)了一系列患有并指(趾)的大家系。其中最重要的是1995年Sayli在土耳其發(fā)現(xiàn)的一個完整的大家系。該家系共有7代,其中病人182人,這顯然是由于奠基者效應(yīng)所引起的。同年Akarsu詳細(xì)描述了這一罕見的大家系的臨床表現(xiàn)。通過對這一罕見家系的遺傳學(xué)研究,Sarfarazi將SPD遺傳基因座定位于2q31,間距為1.7cM。這一結(jié)果提示HOXD同源基因簇中的基因突變有可能是導(dǎo)致SPD的原因。其中發(fā)生在HOXD8基因處的重組排除了基因簇中3′端方向基因致病的可能性,5′端方向的基因,特別是HOXD13、EVX2、DLX2、DLX1則很有可能是本病的致病基因。隨后,在其他家系中的工作進(jìn)一步證實了這一遺傳基因座。1996年,Akarsu對Sayli報道的家系的遺傳學(xué)分析,在HOXD13基因產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)一24個多聚丙氨酸的重復(fù)。正常人的HOXD13基因在翻譯起始位點下游145bp處,編碼一段15個丙氨酸的肽段,而在純合子病人中由于堿基的插入,這一肽段延長達(dá)24個丙氨酸。之后,在其他的家系中也在HOXD13基因中發(fā)現(xiàn)了9個多聚丙氨酸的插入,證實了HOXD13基因的突變是導(dǎo)致Ⅱ型并指的原因之一。HOXD基因是由13個同源基因構(gòu)成的一同源基因簇,它屬于同源異型基因簇(Hoxgenecluster)中的一種。Hox基因簇在發(fā)育上十分古老,動物發(fā)育過程中它對肢體形態(tài)的形成有著重要的調(diào)節(jié)作用。Hox基因簇編碼一系列轉(zhuǎn)錄因子,在發(fā)育中將不同的定位信息傳送到肌體不同部位,使得肌體各部位能夠各自獨立而又協(xié)調(diào)地發(fā)展。HOXD基因簇中的9個同源基因(HOXD1,-D3,-D4,-D8,-D9,-D10,-D11,-D12,-D13)根據(jù)其距著絲粒的遠(yuǎn)近,按由遠(yuǎn)到近的順序在染色體上依次排列。其上游近著絲粒方向,依次排列著EVX2基因和7個保守的調(diào)控元件。Kmita通過定位重組的方法,對小鼠體內(nèi)HOXD基因簇中的基因和其上游的調(diào)控元件分別進(jìn)行敲除和重復(fù),然后各自表達(dá),觀察不同基因?qū)π∈笾w發(fā)育的影響。結(jié)果顯示,HOXD基因簇中不同基因或其上游調(diào)控因子的重復(fù)或缺失都可能影響手指關(guān)節(jié)的發(fā)育,從而造成指(趾)數(shù)目或形態(tài)的異常。Kmita認(rèn)為其原因可能是因為,在HOXD基因簇的遠(yuǎn)端有一增強(qiáng)子,這一遠(yuǎn)端增強(qiáng)子對HOXD基因存在增強(qiáng)作用,但HOXD同源基因之間對這種增強(qiáng)作用存在競爭性抑制,使得遠(yuǎn)端增強(qiáng)子的增強(qiáng)作用具有極性效應(yīng),越靠近5′端增強(qiáng)子作用越明顯,從5′端向3′端增強(qiáng)子作用逐漸減弱。此前Goodman也曾發(fā)現(xiàn)一SPD家系中出現(xiàn)一117kb的染色體片段缺失。該缺失的片段