雨生紅球藻厚壁孢子破壁方法的研究

雨生紅球藻厚壁孢子破壁方法的研究

也就是說，3、3二羥基湖水4、二羥基二醇基、c0h124和52o4的甲基是早期的。它在20世紀30年代從蝦和螃蟹的外殼中分離出來。蝦青素是脂溶性色素,具有艷麗的紅色和強的抗氧化性能。在食品工業(yè)中,它不僅能有效地起到保鮮、保色、保味、保質(zhì)等作用,而且還能為多類食品著色,增加食品的色澤美感。動物試驗表明,蝦青素具有抑制腫瘤發(fā)生、增強免疫功能等多方面的生理作用,因此在功能食品和醫(yī)藥等方面應(yīng)用廣泛。雨生紅球藻是1種生活在淡水中的單細胞綠藻,在特定條件下能積累大量的類胡蘿卜素(可達干重的2%~5%),其中80%以上為蝦青素及其酯類。根據(jù)雨生紅球藻的生活周期,主要分為營養(yǎng)細胞和厚壁孢子。一般認為當(dāng)環(huán)境有利時,主要以綠色、能運動的藻體形式存在;當(dāng)環(huán)境不利時,形成厚壁孢子并大量累積蝦青素。雨生紅球藻的厚壁孢子具有堅韌的細胞壁,若直接利用,則其生物有效利用率低,且堅韌的細胞壁也可阻礙有機溶劑進入細胞內(nèi)提取蝦青素。因此在蝦青素提取前必須對孢子態(tài)細胞進行破壁處理,以破壞雨生紅球藻的細胞結(jié)構(gòu)。本文僅從幾種常用的物理破壁法入手,研究較好的破壁方法及其工藝條件。1材料和方法1.1試驗材料雨生紅球藻原藻種:由中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫提供。培養(yǎng)基:BBM培養(yǎng)基組分見文獻。蝦青素標準樣品:市購,Sigma公司。1.2光照培養(yǎng)箱、飲料CARY50BIO紫外-可見分光光度計;150C數(shù)顯光照培養(yǎng)箱,江蘇省金壇市榮華食品有限公司;Sonics超聲波破碎儀,日本;LD-42低速離心機,北京醫(yī)用離心機廠;GYB60-65高壓均質(zhì)機,上海東華高壓均質(zhì)機廠。1.3方法1.3.1藻類繁殖藻種經(jīng)BBM培養(yǎng)基23℃下培養(yǎng)10d,經(jīng)低速離心沉淀,棄去上清液,加入缺氮培養(yǎng)基,5000lx光照強度下繼續(xù)培養(yǎng)7d。1.3.2葉綠素的處理移取經(jīng)蝦青素誘導(dǎo)試驗后的藻種,4000r/min離心15min,去除上清液,加30%甲醇和5%氫氧化鉀混合液于65℃下處理15min,去除葉綠素。蒸餾水洗滌2次,備用。1.3.3細胞計數(shù)按照KobayashiM等的方法,用“浮游生物計數(shù)框”進行細胞計數(shù),計算細胞破碎前、后完整細胞的數(shù)目。計算公式為:ξ=(未破壁細胞數(shù)目-破壁后完整細胞數(shù)目)/未破壁細胞數(shù)目1.3.4蝦青素的測定1.3.5總含量測定1.3.6干重計算公式取10mL孢子態(tài)藻細胞懸浮液,離心去除上清液,蒸餾水洗滌2次,置于80℃烘箱內(nèi)烘干24h,冷卻后稱衡重。1.3.7計算蝦青素提取率i的計算2結(jié)果與分析2.1均質(zhì)工藝條件的篩選根據(jù)高壓均質(zhì)原理,通過選定均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)、均質(zhì)溫度和空列四因素三水平的(L934)正交設(shè)計表,研究均質(zhì)條件對細胞破壁率和蝦青素提取率的影響,以選取最佳均質(zhì)工藝條件。正交試驗結(jié)果見表1。表2、表3方差分析結(jié)果表明,均質(zhì)壓力和次數(shù)對破壁率及蝦青素提取率均有較顯著的影響,而均質(zhì)溫度影響不大,可在室溫條件下操作。破壁率和蝦青素提取率均隨均質(zhì)壓力和次數(shù)的增大而增大。經(jīng)過40MPa、3次均質(zhì)后,雨生紅球藻破壁率可達91.4%。2.2超聲強度和時間對蝦青素提取率的影響超聲波破壁常用頻率為15~25kHz。根據(jù)文獻報道,在固定超聲波頻率作用下,超聲波作用強度和時間是超聲波破壁的主要影響因素。因此在固定頻率下改變超聲波處理的強度和時間,探討超聲波作用強度和時間對細胞破壁率和蝦青素提取率的影響(結(jié)果見圖1~圖4)。如圖1與圖2所示,超聲波作用強度和時間對細胞破壁率的影響呈線性關(guān)系,即超聲波強度越大,作用時間越長,破壁率越高。但蝦青素的提取率卻不隨作用強度和時間的增大而增大。在25W最大強度下超聲波作用15~30min,蝦青素的提取率達到最大值。當(dāng)作用強度超過25W、作用時間超過30min,蝦青素的提取率反而降低。其原因可能是由于空化效應(yīng)引起提取液局部高溫、高壓,使得溶液產(chǎn)生了H·和HO·等自由基,這些強氧化性的自由基使得蝦青素分子中的共軛雙鍵發(fā)生氧化降解。超聲波作用強度越大,作用時間越長,因空化作用而產(chǎn)生的強氧化性自由基就越多,從而導(dǎo)致蝦青素提取率的下降。2.3冷凍溫度和時間對細胞破壁的影響凍融法也常用于細胞破壁。根據(jù)凍融破壁的主要影響因素,研究了冷凍溫度和冷凍時間對細胞破壁的影響。凍融后蝦青素提取率的比較結(jié)果見表4。結(jié)果表明,冷凍時間和冷凍溫度對蝦青素提取率無明顯影響。2.4超聲波破壁效果的細根據(jù)不同物理破壁方法的較優(yōu)條件做相同藻種、不同破壁條件的比較試驗,結(jié)果見表5。試驗結(jié)果表明,均質(zhì)法破壁率與提取率均相對較高,其操作設(shè)備比超聲波的簡單,可大規(guī)模操作,成本低,周期也較短。超聲波破壁效果比均質(zhì)法的稍差,設(shè)備較昂貴,在處理過程中易發(fā)熱,需用冰水冷卻,因而操作成本較高。而反復(fù)凍融法的效果更差,雖然其操作最為簡單,但操作周期較長,破壁率以及色素提取率都很低。超聲波+均質(zhì)處理后的提取率僅比反復(fù)凍融法稍高一點,但其操作周期較長,對色素破壞性較大。因此,對雨生紅球藻厚壁孢子細胞,只要在40MPa下反復(fù)均質(zhì)3次,破壁率即可達91.4%,提取率可達28.0μg/mg(細胞干重)。3蝦青素提取率高壓均質(zhì)法最適合于雨生紅球藻的細胞壁破碎,其操作的優(yōu)化條件為:40MPa,循環(huán)3次,破壁率可達91.4%,蝦青素提取率為28.02μ