目的基因的克隆與基因文庫(kù)的構(gòu)建精美生物醫(yī)學(xué)講課課件

請(qǐng)你找找看……什么是基因文庫(kù)，由哪兩部分組成呢？構(gòu)建基因文庫(kù)由什么用呢？構(gòu)建一個(gè)基因文庫(kù)都有哪些基本步驟，請(qǐng)概括！請(qǐng)你找找看……什么是基因文庫(kù)，由哪兩部分組成呢？一．基因文庫(kù)概述

1、概念基因文庫(kù)(library)：一套包含某生物體所有基因的DNA序列。這些序列分別與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合在一起。一．基因文庫(kù)概述1、概念2、基本組成包括：基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù)cDNA：由mRNA逆轉(zhuǎn)錄的DNA，因此不含非轉(zhuǎn)錄的基因組序列。單鏈cDNA可由DNA聚合酶轉(zhuǎn)變成雙鏈，應(yīng)用于基因工程。

2、基本組成包括：基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù)出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫(kù)構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質(zhì)粒；cDNA文庫(kù)（cDNAlibrary）限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法。a、DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板用于基因組文庫(kù)構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級(jí)載體的裝載量最好大于基因的長(zhǎng)度避免基因被分隔克隆一個(gè)基因文庫(kù)中有幾萬(wàn)個(gè)克隆，目的基因到底在哪個(gè)克隆上呢？cDNA：由mRNA逆轉(zhuǎn)錄的DNA，因此不連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級(jí)在熱作用下，_____斷裂，形成___________轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，建成cDNA文庫(kù)重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選克隆與克隆之間必須存在足夠長(zhǎng)度的重疊區(qū)域以利克隆排序工作量較大，需要了解目的基因的背景知識(shí)基因組文庫(kù)GenomicDNAlibrary使用與切割載體相同的限制酶，將供體生物的基因組DNA切割成許多片段將所有片段連接到載體上，構(gòu)成一個(gè)重組DNA群體這個(gè)群體包含全基因組的遺傳信息出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫(kù)構(gòu)建的載體通常選裝載量cDNA文庫(kù)（cDNAlibrary）

以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA(complementaryDNA，cDNA)將雙鏈cDNA與適當(dāng)載體連接轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，建成cDNA文庫(kù)cDNA文庫(kù)（cDNAlibrary）以mRNA為模基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較：基因組文庫(kù)包含基因組的所有基因cDNA文庫(kù)只包括某一特定細(xì)胞類型、某一組織、或某一發(fā)育時(shí)期的表達(dá)序列分離特定基因，cDNA庫(kù)比較方便研究調(diào)控序列，必須用到基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較：基因組文庫(kù)包含基因組的所有3、構(gòu)建目的創(chuàng)建基因文庫(kù)的目的：從特定的材料中分離目的DNA片段或基因。把所有的基因集中在一個(gè)庫(kù)中，采用一定的方法在庫(kù)中篩選目的基因。同時(shí)也便于基因的長(zhǎng)期保存。3、構(gòu)建目的創(chuàng)建基因文庫(kù)的目的：從特定的材料中分離目4、基因文庫(kù)的構(gòu)建流程（1）基因組文庫(kù)的構(gòu)建提取某生物全部DNA用適當(dāng)限制酶切割許多DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物基因組文庫(kù)（每個(gè)受體菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文庫(kù)的構(gòu)建——mRNA反轉(zhuǎn)錄形成mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物cDNA文庫(kù)4、基因文庫(kù)的構(gòu)建流程（1）基因組文庫(kù)的構(gòu)建提取某生物用適5、基因文庫(kù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)盡可能高的完備性重組克隆的總數(shù)不宜過(guò)大以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長(zhǎng)度避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長(zhǎng)度的重疊區(qū)域以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選5、基因文庫(kù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)盡可能高的完備性重組克隆的總數(shù)不二、目的基因的克隆二、目的基因的克隆用限制酶切斷成許多片段1、直接分離法—“鳥(niǎo)槍法”載入運(yùn)載體導(dǎo)入不同的受體細(xì)胞大量復(fù)制和表達(dá)找出含有目的基因的細(xì)胞限制酶將DNA切成許多片段用限制酶切斷成許多片段1、直接分離法—“鳥(niǎo)槍法”載入運(yùn)載體鳥(niǎo)槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識(shí)不能獲得的最小長(zhǎng)度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)鳥(niǎo)槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景2、人工合成基因法：1）逆轉(zhuǎn)錄法：mRNA雙鏈DNA(即目的基因)逆轉(zhuǎn)錄酶單鏈DNA合成2）直接合成法：蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因（雙鏈）化學(xué)合成2、人工合成基因法：1）逆轉(zhuǎn)錄法：mRNA雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶3、通過(guò)DNA合成儀直接合成目的基因DNA合成儀蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推測(cè)推測(cè)合成

當(dāng)基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測(cè)得或核苷酸序列已知時(shí)，可采用此種方法。3、通過(guò)DNA合成儀直接合成目的基因DNA合成儀蛋白質(zhì)的氨基4、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①概念：PCR全稱為_(kāi)______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段4、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①概念：PCR全稱為_(kāi)___5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G1.目的基因受熱變性，解旋；2.引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合；3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物Ⅱ1.目(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增②原理：__________DNA復(fù)制③條件：_______________________、

_______________、______________、

__________(做啟動(dòng)子)。已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對(duì)引物DNA聚合酶、解旋酶④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n⑤結(jié)果：使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增②原理：__________DNA復(fù)⑥過(guò)程：a、DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈⑥過(guò)程：a、DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板b、從基因庫(kù)中篩選特定的克隆（2）cDNA文庫(kù)的構(gòu)建——mRNA反轉(zhuǎn)錄形成反應(yīng)體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測(cè)序引物；重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選的DNA片段或基因。當(dāng)基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測(cè)得或核苷酸序列已知時(shí)，可采用此種方法。這個(gè)群體包含全基因組的遺傳信息基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較：重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒克隆片段易于從載體分子上完整卸下限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法。二、篩選：從基因文庫(kù)中篩選目的基因找出含有目的基因的細(xì)胞基因組文庫(kù)GenomicDNAlibrary三、基因文庫(kù)的構(gòu)建（一）切割：基因組DNA的分解用于基因組文庫(kù)構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法。超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭部分酶切法一般選用四對(duì)堿基識(shí)別序列的限制性內(nèi)切酶，如：Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級(jí)分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機(jī)連為一體！從基因庫(kù)中篩選特定的克隆三、基因文庫(kù)的構(gòu)建（一）切割：基因組載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫(kù)構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質(zhì)粒；對(duì)于大型基因組（如動(dòng)植物和人類）需使用YAC載體由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫(kù)構(gòu)建的

上述幾種載體的最大裝載量如下：質(zhì)粒l-DNA考斯質(zhì)粒15kb25kb45kbYAC400

kb上述幾種載體的

用于基因文庫(kù)構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌用于基因文庫(kù)構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或密集鋪板（1-10萬(wàn)）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆二、篩選：從基因文庫(kù)中篩選目的基因密集鋪板（1-10萬(wàn)）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆二、篩選：從基因庫(kù)中篩選特定的克隆一個(gè)基因文庫(kù)中有幾萬(wàn)個(gè)克隆，目的基因到底在哪個(gè)克隆上呢？根據(jù)待選基因相關(guān)信息確定篩選方法和條件。最常用的方法是利用DNA探針，用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針，篩選基因文庫(kù)從基因庫(kù)中篩選特定的克隆一個(gè)基因文庫(kù)中有幾萬(wàn)個(gè)克隆，目的基DNA探針（probe）探針是一段能夠與待選目的基因互補(bǔ)的核酸序列DNA、cDNA、寡聚核苷酸單鏈、雙鏈同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、顏色標(biāo)記DNA探針（probe）探針是一段能夠與待選目的基因互補(bǔ)的篩選文庫(kù)質(zhì)?；驇?kù)篩選細(xì)菌混合液在培養(yǎng)在平板上轉(zhuǎn)移到尼龍膜上裂解細(xì)菌變性DNA標(biāo)記探針雜交漂洗放射自顯影或熒光檢測(cè)挑取對(duì)應(yīng)菌落、培養(yǎng)抽提質(zhì)粒篩選文庫(kù)質(zhì)?；驇?kù)篩選陽(yáng)性克隆的分析與鑒定

從基因庫(kù)中篩選出的陽(yáng)性克隆，還需進(jìn)一步分析、鑒定，才能最后得到目的基因測(cè)序自動(dòng)測(cè)序儀功能分析預(yù)測(cè)軟件陽(yáng)性克隆的分析與鑒定從基因庫(kù)中篩選出的陽(yáng)性克隆，還需進(jìn)一磷酸二脂鍵磷酸二脂鍵測(cè)序電泳圖譜測(cè)序電泳圖譜基因測(cè)序及分析基因測(cè)序及分析30序列測(cè)定的技術(shù)

雜交測(cè)序法質(zhì)譜法單分子測(cè)序法原子探針顯微鏡測(cè)序法DNA芯片法經(jīng)典方法:Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger,1977)Maxam-GilbertDNA化學(xué)降解法(Maxam&Gilbert,1977)新技術(shù)方法:序列測(cè)定的技術(shù)雜交測(cè)序法經(jīng)典方法:新技術(shù)方法:31連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級(jí)1、直接分離法—“鳥(niǎo)槍法”二、篩選：從基因文庫(kù)中篩選目的基因3、通過(guò)DNA合成儀直接合成目的基因從基因庫(kù)中篩選特定的克隆基因組文庫(kù)包含基因組的所有基因1、直接分離法—“鳥(niǎo)槍法”一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。鳥(niǎo)槍法克隆目的基因的局限性鳥(niǎo)槍法克隆目的基因的局限性基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較：（2）cDNA文庫(kù)的構(gòu)建——mRNA反轉(zhuǎn)錄形成目的基因受熱變性，解旋；基因組文庫(kù)GenomicDNAlibrary反應(yīng)體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測(cè)序引物；與PCR反應(yīng)類似。反應(yīng)體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和測(cè)序引物；反應(yīng)過(guò)程：變性－復(fù)性－延伸－終止Sanger雙脫氧終止法連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級(jí)與32Dideoxynucleotides

（雙脫氧核苷酸）ddNTPs是反應(yīng)終止劑可以當(dāng)作正常堿基參與復(fù)制，一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。反應(yīng)體系中dNTPs的濃度遠(yuǎn)高于ddNTPs(一般1：3~4)。Dideoxynucleotides

（雙脫氧核苷酸）ddN33*少一個(gè)－OH脫氧核甘酸與雙脫氧核甘酸結(jié)構(gòu)比較*少一個(gè)－OH脫氧核甘酸34Sanger第一步：加入復(fù)制終止劑熒光檢測(cè)探頭電泳，看誰(shuí)跑得快Sanger第一步：加入復(fù)制終止劑熒光檢測(cè)探頭電泳，看誰(shuí)跑得35ddNTPs參與下的DNA復(fù)制Sanger法測(cè)序產(chǎn)物的平均鏈長(zhǎng)取決于ddNTP：dNTP的比例，比例高時(shí)，得到較短的產(chǎn)物；“標(biāo)記／終止法”測(cè)序產(chǎn)物的平均長(zhǎng)度可通過(guò)標(biāo)記反應(yīng)中dNTP濃度(高濃度能得到長(zhǎng)的產(chǎn)物)或終止反應(yīng)的ddNTP:dNTP來(lái)調(diào)整。

ddNTPs參與下的DNA復(fù)制Sanger法測(cè)序產(chǎn)物的平均鏈36Sanger第二步：熒光檢測(cè)Sanger第二步：熒光檢測(cè)37工作量較大，需要了解目的基因的背景知識(shí)的DNA片段或基因。根據(jù)待選基因相關(guān)信息確定篩選方法和條件。（2）cDNA文庫(kù)的構(gòu)建——mRNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNA文庫(kù)（cDNAlibrary）重組克隆的總數(shù)不宜過(guò)大以減輕篩選工作的壓力反應(yīng)體系中dNTPs的濃度遠(yuǎn)高于ddNTPs(一般1：3~4)。ddNTPs是反應(yīng)終止劑連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級(jí)可以當(dāng)作正常堿基參與復(fù)制，一個(gè)基因文庫(kù)中有幾萬(wàn)個(gè)克隆，目的基因到底在哪個(gè)克隆上呢？鳥(niǎo)槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識(shí)這些序列分別與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合在一起。載體的裝載量最好大于基因的長(zhǎng)度避免基因被分隔克隆一．基因文庫(kù)概述

1、概念基因文庫(kù)(library)：一套包含某生物體所有基因的DNA序列。這些序列分別與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合在一起。工作量較大，需要了解目的基因的背景知識(shí)一．基因文庫(kù)概述1、5、基因文庫(kù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)盡可能高的完備性重組克隆的總數(shù)不宜過(guò)大以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長(zhǎng)度避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長(zhǎng)度的重疊區(qū)域以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整