氨基酸的分離鑒定-紙層析法課件

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教案生化小老師一組生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室生化小老師團(tuán)隊(duì)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教案生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室生化小老師團(tuán)隊(duì)氨基酸的分離鑒定——紙層析法3，5—二硝基水楊酸比色法測(cè)還原糖和總糖含量氨基酸的分離鑒定——紙層析法3，5—二硝基水楊酸比色法測(cè)還原氨基酸的分離鑒定——紙層析法實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)試劑與儀器實(shí)驗(yàn)步驟注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析氨基酸的分離鑒定——紙層析法實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)試劑與儀器實(shí)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握氨基酸紙層析法的原理2熟悉紙層析法的實(shí)驗(yàn)操作3分離鑒別未知氨基酸樣品的成分。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握氨基酸紙層析法的原理2熟悉紙層析法的實(shí)驗(yàn)操作3實(shí)驗(yàn)原理紙層析紙層析法屬于分配層析，層析濾紙為載體，流動(dòng)相是指層析液，在毛細(xì)拉力作用下，層析液能不斷由下向上流動(dòng)。固定相是指被吸附在濾紙纖維之間的水分。由于纖維素上的羥基具親水性使這部分水束縛在纖維素周圍，不易擴(kuò)散而成為固定相。實(shí)驗(yàn)原理紙層析實(shí)驗(yàn)原理在層析過(guò)程中，當(dāng)層析液在毛細(xì)拉力作用下，上升流經(jīng)濾液滴點(diǎn)時(shí)，滴點(diǎn)上的氨基酸就相繼融入層析液，隨著層析液上升，并發(fā)生在分配，即有一部分色素從層析液分配溶解到固定相中，直到平衡。由于分配系數(shù)的不同，那些分配系數(shù)大的氨基酸分子，隨層析液向上移動(dòng)得快，形成的斑點(diǎn)集中在濾紙的上部；而分配系數(shù)小的氨基酸分子，隨層析向上移動(dòng)得慢，形成的斑點(diǎn)集中在濾紙的下面。實(shí)驗(yàn)原理在層析過(guò)程中，當(dāng)層析液在毛細(xì)拉力作用下，上升流經(jīng)濾液實(shí)驗(yàn)原理分配系數(shù)指一定溫度下,處于平衡狀態(tài)時(shí)，組分在固定相中的濃度和在流動(dòng)相中的濃度之比，以K表示。分配系數(shù)反映了溶質(zhì)在兩相中的遷移能力及分離效能，是描述物質(zhì)在兩相中行為的重要物理化學(xué)特征參數(shù)。在同一實(shí)驗(yàn)條件下，比移值Rf主要取決于分配系數(shù)，不同的物質(zhì)分配系數(shù)不同，也就有不同的Rf。此外，溶劑的溶質(zhì)的性質(zhì)、濾紙的性質(zhì)、展層的溫度和pH值均會(huì)影響比移值Rf。在層析過(guò)程中，當(dāng)層析液在毛細(xì)拉力作用下，上升流經(jīng)濾液滴點(diǎn)時(shí)，滴點(diǎn)上的氨基酸就相繼融入層析液，隨著層析液上升，并發(fā)生在分配，即有一部分色素從層析液分配溶解到固定相中，直到平衡。由于分配系數(shù)的不同，那些分配系數(shù)大的氨基酸分子，隨層析液向上移動(dòng)得快，形成的斑點(diǎn)集中在濾紙的上部；而分配系數(shù)小的氨基酸分子，隨層析向上移動(dòng)得慢，形成的斑點(diǎn)集中在濾紙的下面。Rf=原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離原點(diǎn)到溶劑前沿的距離實(shí)驗(yàn)原理分配系數(shù)原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離原點(diǎn)到溶劑前沿的距離實(shí)驗(yàn)原理茚三酮的顯色原理氨基酸與茚三酮水合物在弱酸條件下共加熱時(shí)，氨基酸被氧化脫氨、脫羧，而茚三酮水合物被還原，其還原物可與氨基酸加熱分解產(chǎn)生的氨結(jié)合，再與另一分子茚三酮縮合成為藍(lán)紫色化合物，稱為羅曼紫（Ruhemann'spurple）。實(shí)驗(yàn)原理茚三酮的顯色原理實(shí)驗(yàn)試劑與儀器試劑

純凈的賴氨酸、亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸8×10E-3mol/L溶液；四種氨基酸混合溶液（每種濃度與對(duì)應(yīng)純凈溶液一致）；2.5%茚三酮丙酮溶液；酸性展層劑（正丁醇：88%甲酸：水=60：17：8）。儀器

鐘罩×1、培養(yǎng)皿×1、小燒杯10ml×1、層析柱×1、小漏斗×1、新華一號(hào)濾紙（14cm×17cm）×1、電吹風(fēng)、烘箱、毛細(xì)管、訂書機(jī)，及其他常用儀器。實(shí)驗(yàn)試劑與儀器試劑實(shí)驗(yàn)步驟點(diǎn)樣平衡層析顯色實(shí)驗(yàn)步驟點(diǎn)樣平衡層析顯色點(diǎn)樣取潔凈濾紙一張，在距底邊2cm線上取五個(gè)點(diǎn)（每?jī)牲c(diǎn)相隔距離2cm），分別用毛細(xì)管將各氨基酸樣品點(diǎn)在五個(gè)點(diǎn)上，點(diǎn)樣大小以直徑3mm左右為宜，不要超過(guò)5mm，冷風(fēng)吹干，重復(fù)點(diǎn)樣一次，吹干。實(shí)驗(yàn)步驟點(diǎn)樣實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟平衡將濾紙卷成柱狀將兩邊緣對(duì)齊（注意不要讓兩端接觸，造成層析液上升高度不一致），并用訂書機(jī)訂好，將濾紙豎直放置在潔凈的培養(yǎng)皿中（不要接觸培養(yǎng)皿壁），旁邊擺放一個(gè)內(nèi)盛展開(kāi)劑的小燒杯，蓋上鐘罩平衡30min。實(shí)驗(yàn)步驟平衡實(shí)驗(yàn)步驟層析平衡結(jié)束后，打開(kāi)鐘罩上端塞子，通過(guò)已潤(rùn)洗的“漏斗—層析柱”裝置向培養(yǎng)皿內(nèi)加入展層劑30～40ml至液面達(dá)到培養(yǎng)皿2/3處為宜（層析柱不能碰到濾紙），小心抽出裝置（不要讓層析液滴落在濾紙上），蓋上塞子開(kāi)始層析，直到前沿達(dá)到距濾紙上端1cm刻線處（此過(guò)程2～3小時(shí)）。實(shí)驗(yàn)步驟層析實(shí)驗(yàn)步驟顯色取出層析好的濾紙（需帶手套），拆開(kāi)訂書釘，用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干。將濾紙放入烘箱烘烤5min左右，待顯色后取出。用鉛筆輕輕描出顯色斑點(diǎn)的形狀，找到中心點(diǎn)，測(cè)出中心點(diǎn)與原點(diǎn)水平線的距離，計(jì)算各種氨基酸的比移值Rf，判斷混合點(diǎn)上端各點(diǎn)是什么氨基酸。實(shí)驗(yàn)步驟顯色注意事項(xiàng)1.整個(gè)操作過(guò)程需帶手套進(jìn)行，不要對(duì)著濾紙說(shuō)話，以免濾紙被污染。2.點(diǎn)樣時(shí)應(yīng)注意毛細(xì)管的取放，以免污染試劑。3.點(diǎn)樣吹干時(shí)不宜吹得過(guò)干。4.柱狀濾紙邊緣盡量保持豎直，邊緣的坡度會(huì)影響層展的速率及效果。訂的釘子上下各兩顆為宜。注意事項(xiàng)1.整個(gè)操作過(guò)程需帶手套進(jìn)行，不要對(duì)著濾紙說(shuō)話，以實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析——圖像實(shí)例實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析——圖像實(shí)例——各氨基酸比移值Rf實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析氨基酸賴氨酸天冬氨酸丙氨酸亮（白）氨酸Rf0.22940.38140.57710.8609在同一實(shí)驗(yàn)條件下，比移值Rf主要取決于分配系數(shù)，不同的物質(zhì)分配系數(shù)不同，也就有不同的Rf。此外，溶劑的溶質(zhì)的性質(zhì)、濾紙的性質(zhì)、展層的溫度和pH值均會(huì)影響比移值Rf。實(shí)驗(yàn)中，Rf值與個(gè)人操作及具體實(shí)驗(yàn)條件息息相關(guān)，存在一定波動(dòng)，但總體趨勢(shì)相同?！靼被岜纫浦礡f實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析氨基酸賴氨酸天冬氨酸丙氨——思考問(wèn)題實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析層析過(guò)程中，濾紙上前沿會(huì)出現(xiàn)些許黃色物質(zhì)，你認(rèn)為這是什么？為生整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程需要戴手套進(jìn)行？簡(jiǎn)述你認(rèn)為怎樣點(diǎn)樣可以得到較小斑點(diǎn)。為什么要平衡？——思考問(wèn)題實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析層析過(guò)程中，濾紙上前沿會(huì)出現(xiàn)些許黃3，5—二硝基水楊酸比色法測(cè)還原糖和總糖含量實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)試劑與儀器實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析注意事項(xiàng)3，5—二硝基水楊酸比色法測(cè)還原糖和總糖含量實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊徽莆誅NS比色法測(cè)定糖含量的原理二熟練比色法測(cè)糖的基本操作三掌握分光光度計(jì)的使用方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊徽莆誅NS比色法測(cè)定糖含量的原理二熟練比色法測(cè)糖的實(shí)驗(yàn)原理還原糖在堿性條件下加熱被3，5—二硝基水楊酸（DNS）氧化成糖酸及其他產(chǎn)物，3，5—二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3—氨基—5—硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比例關(guān)系，利用分光度計(jì)，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值，測(cè)繪并查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算還原糖及總糖含量實(shí)驗(yàn)原理還原糖在堿性條件下加熱被3，5—二硝基水楊酸（DNS實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)試劑與儀器小麥面粉3，5—二硝基水楊酸（DNS試劑）：將6.3gDNS和262mL2mol/LNaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，貯于棕色瓶中備用。1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液

準(zhǔn)確稱取80℃烘至恒重的分析純葡萄糖100mg，置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，混勻，4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?碘化鉀溶液、酚酞試劑、6mol/LHCL及6mol/LNaOH溶液主要試劑：實(shí)驗(yàn)試劑與儀器小麥面粉主要試劑：實(shí)驗(yàn)試劑與儀器具塞玻璃刻度試管：20mL×10、普通小試管2只、離心管：10mL×2、容量瓶：50mL×1，100ml×1、吸量管：1mL×1；2mL×2、點(diǎn)滴板、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、電子天平、分光光度計(jì)、膠頭滴管、玻璃棒等其他常規(guī)儀器。主要儀器：實(shí)驗(yàn)試劑與儀器具塞玻璃刻度試管：20mL×10、普通小試管2實(shí)驗(yàn)步驟還原糖的提取：稱取0.30g小麥面粉于試管中加入5ml左右蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍?0℃水浴20min水浴后，將所有溶液轉(zhuǎn)移至離心管中（應(yīng)盡量將試管洗滌干凈），以4000r/min轉(zhuǎn)速離心5min將上層清液倒入50ml容量瓶中，向盛有固體的離心管中加入適量蒸餾水重新使固液混勻，重復(fù)上步操作進(jìn)行二次離心將上層清液倒入50ml容量瓶中，定容至50ml，即得到還原糖樣品待測(cè)溶液實(shí)驗(yàn)步驟還原糖的提?。悍Q取0.30g小麥面粉于試管中加入5m實(shí)驗(yàn)步驟稱取0.10g面粉于試管中，加入1.5ml蒸餾水和1.0ml6mol/L鹽酸，搖勻，沸水浴30min水浴后，可用碘—碘化鉀試劑檢驗(yàn)淀粉是否水解完全，水解完全后，滴入一滴酚酞試劑，用NaOH溶液滴定至溶液微紅將溶液容至100ml，即得到總糖樣品待測(cè)溶液總糖的提?。簩?shí)驗(yàn)步驟稱取0.10g面粉于試管中，加入1.5ml蒸餾水和1實(shí)驗(yàn)步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)繪及還原糖和總糖含量的測(cè)定：1234567、8(還原糖）9、10（總糖）葡萄糖溶液或待測(cè)溶液（ml)00.20.40.60.81.02.00.5蒸餾水（ml)2.01.81.61.41.21.001.5DNS(ml)1.51.51.51.51.51.51.51.5震蕩搖勻溶液，沸水浴5min,冷卻后定容至20ml，上下顛倒混勻，放置約20min將上表中各溶液用分光光度計(jì)測(cè)量吸光度，用1～6號(hào)試管數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將7、8、9、10號(hào)試管所得吸光度和繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，計(jì)算還原糖和總糖的平均含量。實(shí)驗(yàn)步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)繪及還原糖和總糖含量的測(cè)定：123456實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析計(jì)算公式：×××××實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析計(jì)算公式：×××××實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析——參考實(shí)例還原糖：5.13%總糖：82.7%實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析——參考實(shí)例還原糖：5.13%實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析——思考問(wèn)題提取還原糖步驟中為什么要離心？為什么總糖