ph對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響

ph對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響

n-3是重要的生物活性物質(zhì)，具有高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和多種保健功能。海洋微藻具有非常高的合成n-3長(zhǎng)鏈多飽和脂肪酸的能力,日漸成為n-3長(zhǎng)鏈多飽和脂肪酸的新來(lái)源。因此,有關(guān)利用微藻積累n-3長(zhǎng)鏈多飽和脂肪酸的理論研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用倍受人們關(guān)注。眼點(diǎn)擬微綠球藻(Nannochloropsisoculata)是一種重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)微藻,其脂肪酸組成簡(jiǎn)單,富含EPA。目前,日本、澳大利亞等國(guó)家已實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模養(yǎng)殖,國(guó)際市場(chǎng)供不應(yīng)求。研究者發(fā)現(xiàn)在富含氮、磷的培養(yǎng)基中,該藻EPA的含量可以達(dá)到總脂肪酸的35%;眼點(diǎn)擬微綠球藻的總脂含量在穩(wěn)定期含量最高,占干重的43.3%,在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)早期,EPA與總不飽和脂肪酸的比例最高,可達(dá)27.7%。而有關(guān)pH對(duì)該藻的影響規(guī)律少有報(bào)道。本文利用封閉式光合生物反應(yīng)器研究了pH對(duì)該藻的生長(zhǎng)、總脂含量及脂肪酸組成的影響規(guī)律,為更好地進(jìn)行生態(tài)調(diào)控,提高EPA的含量提供了依據(jù)。1材料和方法1.1opyta和真眼點(diǎn)綱藻種眼點(diǎn)擬微綠球藻屬于金藻門(mén)(Chrysophyta),真眼點(diǎn)綱(Eustigmatophyceae)。藻細(xì)胞直徑2~3μm。由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所提供。1.2nano3的磷源、終濃度實(shí)驗(yàn)中所用培養(yǎng)基為Provasoli的加富培養(yǎng)基,氮源為NaNO3,磷源為NaH2PO4·2H2O,氮、磷的終濃度分別為0.924mmol/L、0.085mmol/L,N/P比為10.85(M/M)。培養(yǎng)基均用無(wú)菌海水配制。1.3在線檢測(cè)檢測(cè)參數(shù)實(shí)驗(yàn)中所用密閉式BFC-2光合生物反應(yīng)器為煙臺(tái)高新區(qū)海洋生物工程研究所生產(chǎn)。反應(yīng)器罐體為柱狀,徑高比為1/3,實(shí)際體積為7L,工作體積為6L,培養(yǎng)過(guò)程中的各參數(shù)如溫度、pH、轉(zhuǎn)速、溶氧均能進(jìn)行在線檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)前反應(yīng)器空罐滅菌,121℃,20min。1.4provaoli加富培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)前離心收取藻液400~600ml,將藻泥接種至2L的玻璃三角瓶中,培養(yǎng)體積1L,培養(yǎng)基為無(wú)菌海水配制的Provasoli加富培養(yǎng)基,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。所用玻璃器皿均為高壓蒸汽滅菌。1.5溫度和轉(zhuǎn)速以及光照強(qiáng)度a將活化至對(duì)數(shù)期后期的藻種按1∶5的接種量接種于光合生物反應(yīng)器中,起始OD680值為0.1左右。培養(yǎng)體積為6L,溫度為25±0.5℃,轉(zhuǎn)速為150r/min,光照強(qiáng)度為6400±200lx,光暗周期為12h∶12h。分批培養(yǎng)中每天取樣測(cè)定680nm下的OD值及營(yíng)養(yǎng)鹽消耗情況。在不同的細(xì)胞時(shí)期收取藻液離心、洗滌,在離心收取藻泥后冷凍干燥,藻粉用于總脂和脂肪酸組成分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次,每次實(shí)驗(yàn)至少兩個(gè)平行樣,結(jié)果為平均值。1.6分析與計(jì)算1.6.1細(xì)胞濃度根據(jù)回歸方程y(106cell/ml)=36.883×OD680-0.1076,R2=0.85;由測(cè)得的OD680值,計(jì)算細(xì)胞濃度。1.6.2培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)鹽消耗1.6.3分光光度法測(cè)定藻體總脂占干重的百分比按Ahlgren1991年的分光光度法測(cè)定,由(1)式可得分光光度法的總脂含量,由(2)式換算成重量法結(jié)果。總脂(%干重,重量法)=6.7823×總脂(%干重,光度法)+0.19451.6.4脂肪酸分析及檢測(cè)按Lepage1984年的方法并進(jìn)行了改進(jìn)。在螺口試管中稱取15mg藻粉,加入1ml被KOH飽和的CH3OH溶液,迅速混勻,于75℃水浴中皂化、甲酯化10min,冷卻至室溫后加入約2ml1mol/LHCl-CH3OH溶液使pH≤2,振蕩1min,在75℃水浴酸化10min,冷卻至室溫,加入0.3ml石油醚及少許蒸餾水促進(jìn)分層,充分振蕩,離心后取上層石油醚相進(jìn)行色譜分析。脂肪酸分析采用美國(guó)HP5890II型氣相色譜儀,氫火焰離子化檢測(cè)器,SGEAC20毛細(xì)管珠(30m×0.25mm)。進(jìn)樣后程序升溫:150℃保持1min,以15℃/min升至200℃,再以2℃/min升至250℃。高純氮為載氣,流速1.5ml/min,進(jìn)樣量為1μl。以面積歸一化法得到各脂肪酸組分的相對(duì)百分含量。脂肪酸標(biāo)樣為Sigma公司產(chǎn)品。2結(jié)果2.1眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)pH對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn),在pH為6.8,8.5,9.8的條件下,眼點(diǎn)擬微綠球藻具有大致相同的生長(zhǎng)速率。在對(duì)數(shù)初期,該藻在pH6.8的條件下具有較高的生長(zhǎng)速率;在對(duì)數(shù)后期,在pH8.5,9.8的條件下,眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)較快且細(xì)胞密度較高。在pH6.2的條件下,眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)受到抑制,而在pH5.5的條件下,生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。由圖2,3可見(jiàn),在pH5.5,6.2的條件下,眼點(diǎn)擬微綠球藻的營(yíng)養(yǎng)鹽消耗受到抑制,因而其生長(zhǎng)緩慢,尤其是在pH5.5的條件下,氮源濃度在整個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)幾乎保持不變,磷源濃度在生長(zhǎng)初期無(wú)變化,然后緩緩下降。在pH6.8,8.5,9.8條件下,眼點(diǎn)擬微綠球藻的氮源消耗速率基本相同,而磷源消耗速率有差別,在pH9.8的條件下,其消耗速率最快,其他條件下,消耗速率大致相同。2.2藻總脂含量的變化pH對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻總脂含量的影響見(jiàn)圖4。除pH9.8以外,在所有pH條件下,在一個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)眼點(diǎn)擬微綠球藻總脂含量的變化規(guī)律基本相同。即藻細(xì)胞的總脂含量在對(duì)數(shù)初期有所下降,然后逐漸上升,在穩(wěn)定期達(dá)到最大值。在pH9.2的條件下,總脂含量最高可達(dá)細(xì)胞干重的25.57%。在pH9.8的條件下,眼點(diǎn)擬微綠球藻的總脂含量明顯低于其他條件下的總脂含量,在穩(wěn)定期時(shí)總脂含量?jī)H占生物量干重的10.55%。2.3材料的含量測(cè)定pH對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻脂肪酸組成的影響見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn),16∶0,16∶1和20∶5是眼點(diǎn)擬微綠球藻脂肪酸組成的主要成分,三者占總脂肪酸的60%~70%。在不同pH條件下,在一個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)眼點(diǎn)擬微綠球藻脂肪酸組成的變化規(guī)律基本相同。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期,16∶0與20∶5的含量比較穩(wěn)定,變化不大,而在對(duì)數(shù)后期16:0的含量明顯增加,最高可達(dá)脂肪酸組成的43%;20∶5的含量則明顯降低,甚至僅為脂肪酸組成的8%。18∶1n9的含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,至穩(wěn)定期時(shí)含量明顯增加,最高可由對(duì)數(shù)初期的3.6%增長(zhǎng)為8.8%。14∶0,16∶1,18∶0及20∶4等的含量變化不大。在pH6.2條件下,穩(wěn)定期時(shí)16∶0的含量相對(duì)較低,占總脂肪酸組成的31%,而在堿性條件下,其含量相對(duì)較高,占總脂肪酸組成的40%左右。在對(duì)數(shù)期pH對(duì)EPA(20∶5)含量的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知,在pH6.8的條件下,眼點(diǎn)擬微綠球藻含有較高的EPA約為9.8μg/mg(干重);而在pH9.8的條件下,EPA含量明顯降低,僅為5.1μg/mg(干重),在其他條件下,EPA含量差別不大。3ph對(duì)總脂和epa含量的影響(1)在pH6.8~9.8的范圍內(nèi),眼點(diǎn)擬微綠球藻有較高的生長(zhǎng)速率。在pH5.5,6.2的酸性條件下,營(yíng)養(yǎng)源的吸收受到阻礙,因而藻細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制。一般海洋藻類生存的適宜pH值與海水的pH值相近,為pH8.3左右。不同的藻類生活的適宜pH值不同,偏離此pH值,微藻生長(zhǎng)和體內(nèi)有關(guān)代謝活動(dòng)即受影響。Cohen1988年發(fā)現(xiàn)紫球藻(Porphyridiumcruentum)的理想pH為7.6左右,偏離此值時(shí),藻細(xì)胞生長(zhǎng)變慢。本研究表明眼點(diǎn)擬微綠球藻對(duì)pH有較強(qiáng)的適應(yīng)性,在pH9.8的強(qiáng)堿性條件下,仍然保持很高的生長(zhǎng)速率,只有在偏酸性條件下,由于氮、磷的吸收受到阻礙,生長(zhǎng)才受到抑制。(2)本實(shí)驗(yàn)表明在pH9.8的條件下,眼點(diǎn)擬微綠球藻的總脂含量明顯低于其他pH條件下的總脂含量。在pH6.8的條件下,EPA的含量較高,而在pH9.8的條件下,EPA的含量明顯低于其他pH條件下EPA的含量。有些研究者認(rèn)為培養(yǎng)基酸堿度的改變影響了細(xì)胞內(nèi)外的離子平衡、細(xì)胞膜的滲透性及有關(guān)膜的結(jié)構(gòu)組成。當(dāng)pH的范圍在5.5~8.0之間時(shí),微藻的多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)受pH的影響較小。但Molina等1992發(fā)現(xiàn)等鞭金藻(Isochrysisgalbana)在pH6.0~8.0范圍內(nèi),總脂含量變化不大,但EPA含量,隨pH上升而下降,在pH6.0時(shí)含量最高。本研究也發(fā)現(xiàn)在pH6.8時(shí),眼點(diǎn)擬微綠球藻的EPA含量最高。這表明pH值對(duì)微藻的總脂及EPA含量的影響因藻種的不同而異。在pH9.8時(shí),眼點(diǎn)擬微綠球藻的總脂及EPA含量均明顯低于其他條件下的總脂及EPA含量。這表明在強(qiáng)堿性條件下,眼點(diǎn)擬微綠球藻的脂類合成受到了抑制;生物體內(nèi)長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成都是從16∶0開(kāi)始,通過(guò)一系列脫氫酶、加氧酶和鏈延長(zhǎng)酶類,向長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化,pH可能使此過(guò)程有關(guān)的酶的活性受到影響,因而EPA含量相對(duì)較低。(3)本實(shí)驗(yàn)表明在不同pH條件下,眼點(diǎn)擬微綠球藻的總脂含量在一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)均表現(xiàn)出相同的變化規(guī)律,在對(duì)數(shù)初期總脂含量略有下降,然后逐漸上升,在穩(wěn)定期含量達(dá)到最大值;其脂肪酸組成在一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)也表現(xiàn)出相同的變化規(guī)律。在對(duì)數(shù)期EPA含量較高,穩(wěn)定期時(shí)含量明顯降低,而16∶0和18∶1n9的含量與EPA相反,在穩(wěn)定期其含量明顯升高。Yongmanitchai等1989年表明當(dāng)培養(yǎng)進(jìn)入后期時(shí),許多微藻傾向于以脂類的形式儲(chǔ)存它們的能源。這種脂類通常富含飽和和單不飽和脂肪酸。海洋微藻等鞭金藻在培養(yǎng)后期,脂類是有機(jī)物中的主要成