轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種課件

1轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種1轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種2作物轉(zhuǎn)基因育種就是根據(jù)育種目標(biāo)，從供體生物中分離目的基因，經(jīng)DNA重組與遺傳轉(zhuǎn)化或直接運(yùn)載進(jìn)入受體作物，經(jīng)過(guò)篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的遺傳工程體，并經(jīng)過(guò)田間試驗(yàn)與大田選擇育成轉(zhuǎn)基因新品種或種質(zhì)資源。轉(zhuǎn)基因作物（GMC，geneticallymodifiedcrops）什么是轉(zhuǎn)基因育種?2作物轉(zhuǎn)基因育種什么是轉(zhuǎn)基因育種?3與常規(guī)育種技術(shù)相比，轉(zhuǎn)基因育種在技術(shù)上較為復(fù)雜，要求也很高，但是具有常規(guī)育種所不具備的優(yōu)勢(shì)：1.拓寬可利用的基因資源；2.培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗優(yōu)良品種提供了嶄新的育種途徑；3.可以對(duì)植物的目標(biāo)性狀進(jìn)行定向變異和定向選擇；4.可以大大提高選擇效率，加快育種進(jìn)程。此外，還可將植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物等生物制品。3與常規(guī)育種技術(shù)相比，轉(zhuǎn)基因育種在技術(shù)上較為復(fù)雜，要求也很高4TraditionalcrossbreedingRecombinantDNAtechniques4TraditionalcrossbreedingReco5二、 轉(zhuǎn)基因育種的程序基因分離體外重組轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體安全性評(píng)價(jià)結(jié)合常規(guī)育種轉(zhuǎn)基因品種遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)市場(chǎng)開(kāi)發(fā)載體的構(gòu)建農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因槍轟擊篩選5二、 轉(zhuǎn)基因育種的程序基因分離體外重組轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體安全性評(píng)價(jià)6(一)目的基因的獲得

根據(jù)獲得基因的途徑主要可以分為兩大類：根據(jù)基因表達(dá)的產(chǎn)物—蛋白進(jìn)行基因克?。粡幕蚪MDNA或mRNA序列克隆基因。1.根據(jù)基因表達(dá)的產(chǎn)物—蛋白進(jìn)行基因克隆

主要步驟如下：利用這種方法人類首次人工合成了胰島素基因。雖然在早期采用這種方式已經(jīng)成功地克隆了許多基因。局限性：兼并密碼子效率低未知基因及產(chǎn)物分離蛋白質(zhì)明確氨基酸序列推導(dǎo)核苷酸序列人工合成6(一)目的基因的獲得1.根據(jù)基因表達(dá)的產(chǎn)物—蛋白進(jìn)72.從基因組DNA或mRNA序列克隆基因(1)同源序列法

(HomologyBasedCandidateGeneMethod)根據(jù)基因家族成員所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中具有保守氨基酸序列的特點(diǎn)克隆基因家族未知成員。氨基酸序列比較設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增文庫(kù)篩選/RACE72.從基因組DNA或mRNA序列克隆基因(1)同源序列法8(2)表達(dá)序列標(biāo)簽EST是指能夠特異性標(biāo)記某個(gè)基因的部分序列，通常包含了該基因足夠的結(jié)構(gòu)信息區(qū)，可以與其它基因相區(qū)分。主要是通過(guò)cDNA的途徑獲得。

獲得EST的途徑:

大規(guī)模cDNA文庫(kù)測(cè)序各種mRNA水平的分析手段mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄酶cDNA文庫(kù)PCR差異顯示抑制消減雜交…ESTRACE/文庫(kù)篩選dbESTGenBank8(2)表達(dá)序列標(biāo)簽EST是指能夠特異性標(biāo)記某個(gè)基因的部分9(3)根據(jù)連鎖圖譜克隆目的基因

圖位克隆技術(shù)(Map-basedcloning)9(3)根據(jù)連鎖圖譜克隆目的基因10MarkercM10.8aGenecbpBAC染色體步移亞克隆cDNA文庫(kù)篩選互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)精細(xì)定位染色體步移候選基因10MarkercM10.8aGenecbpBAC染色體步移11(4)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法轉(zhuǎn)座子是染色體上一段可復(fù)制、移動(dòng)的DNA片段。當(dāng)轉(zhuǎn)座子插入到某個(gè)功能基因內(nèi)部時(shí)，就會(huì)引起該基因的失活，并誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型；當(dāng)轉(zhuǎn)座子再次轉(zhuǎn)座或切離這一位點(diǎn)時(shí)，失活基因的功能又可得到恢復(fù)。目前應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是Ac/Ds玉米轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。插入突變體篩選突變DNA文庫(kù)，PCR，RACE鑒定性狀遺傳分析轉(zhuǎn)座子DNA探針基因部分DNA探針篩選野生型DNA文庫(kù)，PCR，RACE完整目的基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)11(4)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法轉(zhuǎn)座子是染色體上一段可復(fù)制、12(5)差異顯示法在生物個(gè)體發(fā)育不同階段，或不同的組織與細(xì)胞中或不同環(huán)境下，基因表達(dá)差異。即不同基因有序的時(shí)空表達(dá)方式，叫做基因的差異表達(dá)。差異顯示PCR(differentialdisplay-PCR,DD-PCR)是指通過(guò)對(duì)來(lái)源特定組織類型的總mRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳，并找出待測(cè)組織和對(duì)照之間的特異擴(kuò)增條帶。葉mRNA根mRNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR隨機(jī)引物+3’

錨定poly(t)引物PCRPAGE葉根12(5)差異顯示法在生物個(gè)體發(fā)育不同階段，或不同的13(6)cDNA微陣列,cDNA芯片cDNA序列（純樣）機(jī)器點(diǎn)樣在支持物,與熒光標(biāo)記的不同mRNA樣品分別進(jìn)行雜交,通過(guò)激光共聚焦掃描分析不同cDNA序列的雜交信號(hào)強(qiáng)度,判斷該cDNA在不同mRNA樣品中的表達(dá)豐度.mRNA1mRNA213(6)cDNA微陣列,cDNA芯片mRNA1mR14(6)電子克隆insilicocloning利用計(jì)算機(jī)技術(shù),依托現(xiàn)有的網(wǎng)絡(luò)資源(EST數(shù)據(jù)庫(kù)、核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)、基因組數(shù)據(jù)庫(kù)等)

，采用同源性序列比對(duì)和歸類分析、重疊區(qū)域組裝和拼接等方法延長(zhǎng)EST序列，直至沒(méi)有與之同源的序列可供拼接為止，所得到的序列可以認(rèn)為是相對(duì)應(yīng)基因的全長(zhǎng)cDNA，根據(jù)所得的cDNA序列設(shè)計(jì)囊括開(kāi)放閱讀框兩端的引物，進(jìn)行RT-PCR克隆出相應(yīng)基因的方法類似于cDNA文庫(kù)的篩選但更加方便和快速。14(6)電子克隆insilicocloning15（二）目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

目的基因體外重組到適當(dāng)?shù)囊迅脑斓馁|(zhì)粒中包括保存用中間載體（大腸桿菌寄主）：pBR322、pUC、

pBluescriptK、pKS,pGEM-T

繁殖載體（大腸桿菌寄主）：JM109,TOP10

植物轉(zhuǎn)化載體（農(nóng)桿菌寄主）：pBI121,pCAM100115（二）目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建目的基因體外重組到適當(dāng)16分離基因克隆到某中間載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒限制酶切/連接克隆到植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌基因槍轉(zhuǎn)化pKS,pBR332,pGEM-TJM109,TOP10…HindIII/EcroI…T4ligasepBI121,pCAM1001…LBA4404,EHA16分離基因克隆到某中間載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒限制酶切/連17農(nóng)桿菌:多用于植物基因工程.包含Ti質(zhì)粒T-DNA(Transferred-DNA),

可以轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物基因組.TumorinducedbyA.tumefaciens17農(nóng)桿菌:多用于植物基因工程.Tumorinduced18TiPlasmidT-DNAregionLeftborderRightbordervirgenesori已知農(nóng)桿菌附著到植物細(xì)胞后，只留在細(xì)胞間隙中。T-DNA首先在細(xì)菌中被加工、剪切、復(fù)制，然后轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。auxin18TiPlasmidT-DNAregionLeftb19Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA分子，其分子量為95～156×106D,約有200kb組成。根據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類不同，Ti質(zhì)?？梢员环殖伤姆N類型：章魚堿型(octopine)胭脂堿型(nopaline)農(nóng)桿堿型（agropine）農(nóng)桿菌素堿型（agrocinopine）或稱琥珀堿型(succinamopine)Ti質(zhì)粒的遺傳特性及類型19Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價(jià)閉合的20Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域

（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）：

農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來(lái)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA，稱為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。（2）Vir區(qū)（virulenceregion）

該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相鄰，約占Ti質(zhì)粒DNA的三分之一。（3）Con區(qū)（regionsencodingconjugations）

該區(qū)段上存在著與細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。（4）Ori區(qū)（originofreplication）

該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。20Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域

（1）T-DNA區(qū)（transfer21野生型Ti質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體，存在如下障礙：①Ti質(zhì)粒分子量過(guò)大，一般在160～240kb，比pBR322質(zhì)粒大50倍左右；②大型的野生Ti質(zhì)粒上分布著各種限制酶的多個(gè)切點(diǎn)，不能通過(guò)體外DNA重組技術(shù)直接向野生型Ti質(zhì)粒導(dǎo)入外源基因；③T-DNA區(qū)內(nèi)含有許多編碼基因，其中Onc基因的產(chǎn)物干擾宿主植物中內(nèi)源激素的平衡，轉(zhuǎn)化細(xì)胞長(zhǎng)成腫瘤，阻礙細(xì)胞的分化和植株的再生；④Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制,即使得到重組質(zhì)粒，也只能在農(nóng)桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增；⑤Ti質(zhì)粒上還存在一些對(duì)于T-DNA轉(zhuǎn)移不起任何作用的基因。21野生型Ti質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體，存在如下障礙：22雙元載體系統(tǒng):binaryTivectorsystem22雙元載體系統(tǒng):binaryTivectorsyst23載體構(gòu)建中常用的選擇標(biāo)記

如何選擇和篩選轉(zhuǎn)化體同樣是一個(gè)重要問(wèn)題?？茖W(xué)家家一直試圖把轉(zhuǎn)化體帶上一個(gè)標(biāo)記，從而便于選擇和篩選。至今己建立了許多標(biāo)記基因，并已插入各種轉(zhuǎn)化載體中，作為一種標(biāo)記基因。23載體構(gòu)建中常用的選擇標(biāo)記如何選擇和篩選轉(zhuǎn)化體同樣是一個(gè)24必須具備以下四個(gè)條件：①編碼一種不存在于正常植物細(xì)胞中的酶；②基因較小，可構(gòu)成嵌合基因；③能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達(dá)；④檢測(cè)容易，并且能定量分析。細(xì)菌篩選標(biāo)記基因：產(chǎn)物給予細(xì)胞產(chǎn)生一種選擇壓力，致使未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長(zhǎng)、發(fā)育與分化。而轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)該標(biāo)記產(chǎn)生抗性，不影響其生長(zhǎng)等，從而將轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇出來(lái)，例如，Cat（氯霉抗性基因）。植物篩選標(biāo)記基因：強(qiáng)調(diào)給轉(zhuǎn)化細(xì)胞帶上一種標(biāo)記，起報(bào)告和識(shí)別作用，故稱報(bào)告基因。

24必須具備以下四個(gè)條件：25報(bào)告基因:

Gus基因（β-葡糖苷酸酶基因）在植物細(xì)胞中所產(chǎn)生的葡糖苷酸酶在檢測(cè)上具有以下特點(diǎn)：①在一定條件下與X-G1ucuionicacid（5-bromo-4-chioro-3-indoyl-β-D-glucuronicacid）底物發(fā)生作用，產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，既可以用分光光度計(jì)法測(cè)定，又可以直接觀察到植物組織中形成的藍(lán)色斑點(diǎn)。②當(dāng)加入4-甲基傘形酮基和葡萄糖苷酸時(shí)生成4-甲基傘形酮，發(fā)熒光（λ=465nm）。因而可以用熒光光譜法測(cè)定。由于熒光強(qiáng)度高，本底低，故熒光檢測(cè)極為靈敏。③檢測(cè)容易、迅速并能定量，只需少量植物組織抽提液即可在短時(shí)間內(nèi)測(cè)定完畢。④價(jià)格便宜。25報(bào)告基因:

Gus基因（β-葡糖苷酸酶基因）262627GFP（綠色熒光蛋白基因）;

LUC(螢火蟲熒光素酶基因);報(bào)告基因:27GFP（綠色熒光蛋白基因）;

LUC(螢火蟲熒光素酶基28啟動(dòng)子的選擇35S,cauliflowermosaicvirus35Spromoter

CaMV35Sisastrongpromoterthatisactiveinessentiallyalldicotplanttissues.

28啟動(dòng)子的選擇35S,cauliflowermosai29(三〕受體材料的選擇

受體是指用于接受外源DNA的轉(zhuǎn)化材料。良好的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應(yīng)滿足如下條件：1、高效穩(wěn)定的再生能力；2、受體材料要有較高的遺傳穩(wěn)定性；3、外植體來(lái)源方便，如胚和其它器官等；4、對(duì)篩選劑敏感；5、轉(zhuǎn)化率高29(三〕受體材料的選擇30常用的受體材料有以下幾大類型:1.愈傷組織再生系統(tǒng)外植體材料經(jīng)過(guò)脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，轉(zhuǎn)化（帶有目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染），分化培養(yǎng)獲得再生植株。優(yōu)點(diǎn)：外植體來(lái)源廣，繁殖快，易接受外源基因，轉(zhuǎn)化效率高。缺點(diǎn)：遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體因此需要連續(xù)的再生系統(tǒng)30常用的受體材料有以下幾大類型:1.愈傷組織再生系統(tǒng)312.直接分化再生系統(tǒng)

外植體材料細(xì)胞不經(jīng)過(guò)脫分化形成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。優(yōu)點(diǎn)：周期短、操作簡(jiǎn)單，體細(xì)胞變異小，遺傳穩(wěn)定；缺點(diǎn)：材料局限，轉(zhuǎn)化率低。3.原生質(zhì)體再生系統(tǒng)原生質(zhì)體恢復(fù)細(xì)胞壁具有分化再生能力，是應(yīng)用最早的再生受體系統(tǒng)之一。優(yōu)點(diǎn)：高效、廣泛地?cái)z取外源DNA或遺傳物質(zhì)，獲得基因型一致的克隆細(xì)胞，所獲轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，適用于多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；缺點(diǎn)：不易制備、再生困難和變異程度高。312.直接分化再生系統(tǒng)3.原生質(zhì)體再生系統(tǒng)324.胚狀體再生系統(tǒng)是指具有胚胎性質(zhì)的個(gè)體。優(yōu)點(diǎn)：個(gè)體數(shù)目巨大、同質(zhì)性好，接受外源基因能力強(qiáng)，嵌合體少，易于培養(yǎng)、再生。缺點(diǎn)：技術(shù)含量高，多數(shù)植物不易獲得胚狀體。5.生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)以生殖細(xì)胞如花粉粒、卵細(xì)胞等受體細(xì)胞進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。一是利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行小孢子和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)；二是直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過(guò)程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導(dǎo)入法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。324.胚狀體再生系統(tǒng)5.生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)33（四）轉(zhuǎn)基因方法概括起來(lái)說(shuō)主要有兩類：第一類是以載體為媒介的遺傳轉(zhuǎn)化，也稱為間接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)法。第二類是外源目的DNA的直接轉(zhuǎn)化。33（四）轉(zhuǎn)基因方法341.載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)基因方法。將外源基因重組進(jìn)入適合的載體系統(tǒng)，通過(guò)載體將攜帶的外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，整合在核染色體組中并隨核染色體復(fù)制和表達(dá)。農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒（tumor-inducingplasmid）或Ri質(zhì)粒(root-indcing

plasmid)介導(dǎo)法是迄今為止植物基因工程中應(yīng)用最多、機(jī)理最清楚、最理想的載體轉(zhuǎn)移方法。341.載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)35農(nóng)桿菌共培養(yǎng)侵染誘導(dǎo)愈傷組織分化生芽生根葉盤轉(zhuǎn)化法(1)葉盤法

雙子葉植物較為常用、簡(jiǎn)單有效的方法。35農(nóng)桿菌共培養(yǎng)侵染誘導(dǎo)愈傷組織分化生芽生根葉盤轉(zhuǎn)化法(1)36

(2)真空滲入法將適宜轉(zhuǎn)化的健壯植株倒置浸于裝有攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌滲入培養(yǎng)基的容器中，經(jīng)真空處理，造傷，使農(nóng)桿菌通過(guò)傷口感染植株，在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下，發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化。簡(jiǎn)便、快速、可靠，不需要組織培養(yǎng)。(3)愈傷組織共培養(yǎng)(4)原生質(zhì)體共培養(yǎng)36(2)真空滲入法372.外源基因直接導(dǎo)入法（1）化學(xué)刺激法細(xì)胞融合劑：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVC）372.外源基因直接導(dǎo)入法38(2)基因槍轟擊法

（微彈轟擊技術(shù)micro-projectilebombardment)將外源DNA包裹在微小的鎢粉或金粉顆粒的表面，借助高壓動(dòng)力射入受體細(xì)胞或組織，最后整合到植物基因組并得以表達(dá)。步驟簡(jiǎn)單易行：適合于大多數(shù)細(xì)胞或組織，克服了受體材料的限制，不必制備原生質(zhì)體，具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用范圍，已經(jīng)成為植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化最有效方法之一。到目前為止，利用基因槍法已經(jīng)在煙草、豆類和多數(shù)禾本科農(nóng)作物、果樹(shù)花卉和林木等植物上獲得轉(zhuǎn)基因植株。單子葉植物38(2)基因槍轟擊法391.撕開(kāi)果皮取出未成熟的胚.2.未成熟的置于培養(yǎng)皿中高滲透介質(zhì)Transformationisperformedbygenegunmethod391.撕開(kāi)果皮取出未成熟的胚.2.未成熟的置于培養(yǎng)皿404041(4)微注射法

細(xì)胞操作：利用瓊脂糖包埋、聚賴氨酸粘連和微吸管吸附等方式將受體細(xì)胞（原生質(zhì)體或生殖細(xì)胞）固定，然后將供體DNA或RNA直接注射進(jìn)入受體細(xì)胞。子房注射法或花粉管通道法：具有較大子房或胚囊的植株可在田間進(jìn)行活體操作。操作簡(jiǎn)便、成本低。41(4)微注射法42（五）轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定1.轉(zhuǎn)化體的篩選外源目的基因轉(zhuǎn)化頻率低目的基因已被整合到核基因組并表達(dá)轉(zhuǎn)化細(xì)胞更少使用特異性選擇標(biāo)記基因（selectablemarkergenes）進(jìn)行標(biāo)記，有效地選擇出真正轉(zhuǎn)化細(xì)胞。常用選擇標(biāo)記基因：抗生素抗性基因除草劑抗性基因?qū)⑦x擇標(biāo)記基因與適當(dāng)啟動(dòng)子構(gòu)成嵌合基因，克隆到質(zhì)粒載體上，與目的基因同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。標(biāo)記基因在受體細(xì)胞表達(dá)，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有抵抗相應(yīng)抗生素或除草劑的能力而存活下來(lái)。非轉(zhuǎn)化細(xì)胞則被抑制、殺死。42（五）轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定432.轉(zhuǎn)化體的鑒定通過(guò)篩選得到的再生植株初步證明標(biāo)記基因整合進(jìn)入受體細(xì)胞。至于目的基因是否