大腸埃希菌質(zhì)粒頭孢菌素酶基因的初步研究

大腸埃希菌質(zhì)粒頭孢菌素酶基因的初步研究

酶c最初是由抗氨基丙烯酸苯磺酸鹽的埃希菌引起的，然后在許多革蘭氏陰性桿菌中發(fā)現(xiàn)了由染色體誘導的磺c酶c。近十多年來,不斷在質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)表達各種AmpC酶的基因。本研究調(diào)查我院大腸埃希菌中質(zhì)粒介導型AmpC酶基因型的分布情況,報道如下。1材料和方法1.1菌株的質(zhì)控指標收集2005～2006年中南大學湘雅三醫(yī)院住院病人中分離的大腸埃希菌157株。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603,產(chǎn)TEM-1、SHV-1、CTX-M-3、DHA-1、ACT-1型β-內(nèi)酰胺酶的菌株作為對照,由上海瑞金醫(yī)院臨床微生物科提供。1.2培養(yǎng)基和試劑抗生素紙片:頭孢他啶(30μg/片),頭孢噻肟(30μg/片),頭孢噻肟/克拉維酸(每片30μg/10μg),頭孢他啶/克拉維酸(每片30μg/10μg),頭孢西丁(30μg/片)及M-H培養(yǎng)基均為英國Oxoid公司產(chǎn)品。阿米卡星(AMK),阿莫西林/克拉維酸(AMC),氨曲南(AZN),頭孢唑啉(CFZ),頭孢吡肟(FEP),頭孢哌酮/舒巴坦(CFS),頭孢噻肟(CTX),頭孢他啶(CAZ),頭孢呋肟(CXM),環(huán)丙沙星(CIP),頭孢西丁(FOX),左氧沙星(LVX),哌拉西林(PIP)由中國藥品生物制品檢定所提供。亞胺培南(IMP)為杭州默沙東公司提供。1.3ss基因編碼區(qū)的處理根據(jù)GenBank收錄的質(zhì)粒型ampC基因和ESBLs基因序列信息,采用PrimerPremier5.0軟件包輔助設計,選擇各型ampC基因和ESBLs基因編碼區(qū)(CDS)保守序列設計通用引物。各型ampC基因和ESBLs基因PCR擴增片段涵蓋其大部分CDS及主要氨基酸替代位點,以便于亞型區(qū)分。擴增ampC基因設計5對通用引物,ESBLs基因設計TEM、SHV、CTX-M型3組通用引物,見表1。各引物均由上海生工生物工程公司合成。質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR純化試劑盒均為上海生工公司產(chǎn)品。PCR儀為AppliedBiosystems公司GeneAmpPCRSystem9700。1.4最低抑菌濃度測定根據(jù)2005年美國臨床實驗室標準化研究所(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI/NCCLS)出版的藥敏試驗指南,用瓊脂稀釋法測定13株CMY-2組和1株DHA-1組PCR擴增陽性菌株對14種抗生素的最低抑菌濃度(MIC)。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。1.5報道方法及結(jié)果采用K-B法,用FOX紙片檢測受試菌株,抑菌圈直徑≤17mm提示對FOX耐藥或中介者為疑產(chǎn)AmpC酶株,確證試驗參照Coudron報道方法進行。陰溝腸桿菌029M為陽性對照,肺炎克雷伯菌ATCC700603為陰性對照。1.6pcr模型準備對24株耐頭孢西丁菌株按質(zhì)粒抽提試劑盒說明書提取細菌質(zhì)粒。以質(zhì)粒作為PCR模板。1.7dntp反應以上述24株菌株的質(zhì)粒作模板,進行PCR,反應體系為PCRPremix(TaKaRa,日本)25μl(含TaKaRaTaq1.25U,dNTP各0.4mmol/L,Mg2+3mmol/L),primerF1μl(20μmol/L),primerR1μl(20μmol/L),質(zhì)粒DNA模板3μl,ddH2O20μl,反應終體積50μl。反應條件為:94℃預變性3min,然后進入PCR循環(huán),94℃變性35s,58～60℃退火30s,72℃延伸1min,35個循環(huán),最后72℃延伸5min。1.8凝膠純化產(chǎn)物的測序用瓊脂糖凝膠電泳法,PCR產(chǎn)物在含0.5μl/ml溴乙錠的15g/L瓊脂糖凝膠中電泳,用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果,照相后切膠回收純化。純化產(chǎn)物直接測序,測序儀器為ABIPRISM3730,同一樣品經(jīng)正、反測序。所測序列采用DNAstar軟件進行序列拼接、校正和氨基酸序列的推導,并與GenBank數(shù)據(jù)庫提供的質(zhì)粒型AmpC酶核苷酸序列進行對比以確定其基因亞型。1.9試驗結(jié)論13株CMY-2組和1株DHA-1組PCR擴增陽性菌株進行接合實驗,步驟參照文獻進行。2結(jié)果2.1產(chǎn)酶基因的檢測結(jié)果157株中對FOX抑菌圈直徑≤17mm共計24株。其中三維實驗陽性者共計16株。2.2esbl基因型檢測24株菌株采用通用引物擴增陽性組有:CMY-2組和DHA-1組。其中CMY-2組有13株(圖1):EC0501、0504、0512、0517、0519、0520、0543、0545、0550、0554、0562、0578、0583。DHA-1組有1株:EC0546。ESBL基因型檢測TEM組有15株陽性:EC0501、0504、0512、0517、0519、0520、0542、0543、0545、0546、0550、0554、0562、0578、0583;SHV型1株陽性:EC0546;CTX-M型有2株陽性為EC0543和0554。2.3gebak比對的比對13株擴增CMY-2組陽性者產(chǎn)物經(jīng)測序,結(jié)果為一新的CMY型AmpC酶,與GenBank的比對發(fā)現(xiàn),最接近的是EscherichiacoliAmpC-EC8(bla(ampc-EC8))gene(DQ092427.1),有98%的同源性。DHA組EC0546測序結(jié)果為DHA-1型。2.4一般實驗菌株EC0543,EC0583和EC0546接合成功。提取質(zhì)粒后,PCR擴增出預期大小的片段(852bp)。2.5合成對頭孢他嗪的耐藥率14株產(chǎn)AmpC酶的大腸埃希菌對第一代、第二代頭孢菌素頭孢唑啉和頭孢呋肟的耐藥率達100%,對第三代頭孢菌素頭孢他啶耐藥率達42.9%,頭孢噻肟耐藥率達100%;對氨曲南、頭孢西丁也全部耐藥;對含酶制劑哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦、左氧沙星、環(huán)丙沙星有不同程度耐藥;對阿米卡星和第四代頭孢菌素頭孢吡肟耐藥率相對較低,對亞胺培南則全部敏感。3內(nèi)標物質(zhì)粒攜帶特性與抗菌藥物耐藥的關系20世紀90年代以前認為AmpC酶由染色體介導產(chǎn)生,自1990年Papanicolaou等人第一次證實了肺炎克雷伯菌攜帶編碼AmpC酶-MIR-1質(zhì)粒后,質(zhì)粒介導的AmpC酶在世界各地以大約每年增加一種的速度不斷被發(fā)現(xiàn),目前已超過40多種。與染色體介導的AmpC酶不同,質(zhì)粒介導的AmpC酶高水平持續(xù)表達,且可通過轉(zhuǎn)化、接合等方式轉(zhuǎn)移給其他菌種,造成耐藥性的廣泛傳播。不同國家質(zhì)粒介導的AmpC酶種類有所不同。在國內(nèi)臨床分離株中所產(chǎn)的ampC基因以DHA型和CIT型為主,而我們發(fā)現(xiàn)的CMY類似AmpC酶的發(fā)生率約8.28%(13/157),這13株中,都同時產(chǎn)TEM型ESBLs,有1株產(chǎn)SHV型,2株同時產(chǎn)CTX-M型ESBLs。這13株大腸埃希菌通過測序并在GenBank中比對,發(fā)現(xiàn)與之最近的是EscherichiacoliAmpC-EC8(bla(ampc-EC8))gene(DQ092427),有98%的同源性,但有多個核苷酸序列的改變,如318位C→T,448位G→A,469位A→T,489位G→T,532位A→G,772位G→C等,所以它應該是GenBank里目前還不曾登錄的基因序列,數(shù)據(jù)正向GenBank提交。在14株大腸埃希菌和攜帶有同樣性質(zhì)的3株接合子擴增出了費氏枸櫞酸桿菌染色體來源的CMY型ampC基因片段和摩氏摩根菌群來源的DHA型ampC基因片段。由于接合子受體菌本身不帶有染色體來源的ampC基因片段,所以接合子擴增