首次從前列腺液中分離到坎皮納斯類芽胞桿菌

首次從前列腺液中分離到坎皮納斯類芽胞桿菌【摘要】目的對分離自慢性前列腺炎患者前列腺液中的一株棒狀樣細(xì)菌進(jìn)行多相分類學(xué)研究，確定其系統(tǒng)發(fā)生位置及分類學(xué)特征。方法利用形態(tài)、生理和生化特性等表型性狀初步鑒定細(xì)菌，通過基因測序及比對明確其種系來源。結(jié)果分離、培養(yǎng)出革蘭陽性棒狀樣桿菌，可形成芽胞；生化反應(yīng)不活潑；BLAST序列比對顯示，該分離株與坎皮納斯類芽胞桿菌（PaenibacillusCampinasensis）菌株324T的16SrDNA序列相似度最高，為99.4%（僅存在9個(gè)核苷酸差異）。結(jié)論從表型性狀和種系發(fā)生結(jié)果可證實(shí)該菌為坎皮納斯類芽胞桿菌。鑒于其與模式株在生化特征方面存在顯著差異，初步考慮該菌株是坎皮納斯類芽胞桿菌的新亞型。本菌種系在國內(nèi)外臨床感染病例中首次分離到?！娟P(guān)鍵詞】前列腺液；棒狀桿菌；P.campinasensis；16SrRNA；分類學(xué)鑒定

IsolationandidentificationofPaenibacilluscampinasensissp.[Abstract]ObjectiveToundertakapolyphasictaxonomicanalysisofanunidentifiedroutinelygram-positivecorynebacteriumwhichwasisolatedfromprostaticfluidofapatientsufferingfromChronicprostatitis,therebytoascertainitsphylogeneticpositionandtaxonomiccharacteristics.MethodsWeundertakedaninitialidentificationbyphenotypiccharacterssuchasmorphologeeal，physiologicalandbiochemicalcharacteristicstoascertainitsphylogenybychemicalcompositionanalysisof16SrRNAgenesequencingandalignment.ResultsAclub-shapedgrampositiverodbacilluswasisolatedinpureculturestate,motilebymeansofperitrichousflagella.Ellipsoidalsporesareformedinswollensporangia.Itsbiochemicalreactionswerenotactive．searchesoftheGenBankdatabaserevealedthatthisstrainhadahighestlevelof16SrDNAsequencesimilarity(99．4％)toP.campinasensis324Twithonly9ribonucleotidesdifferent.ConclusionOnthebasisofphenotypicandphylogeneticanalysis,itisreasonabletoassignthisstraintothespeciesP.campinasensis,.andthisisthefirstisolationofP.campinasensisfromclinicalinfectionshomeandabroad.[Keywords]Qrostaticfluid;Corynebacterium;P.campinasensis;16SrRNA;Taxonomicidentification.

類芽胞桿菌屬包含的細(xì)菌種類繁多，但臨床病例中很少見，近來偶有臨床報(bào)道從人體內(nèi)分離出類芽胞桿菌。我們從一例慢性前列腺炎患者的前列腺液中分離到一株棒狀樣桿菌，該菌生長緩慢，生化反應(yīng)不活潑，且與已合格發(fā)表的棒狀桿菌屬內(nèi)的菌種不同，常規(guī)方法不能鑒定該菌株。系統(tǒng)發(fā)生研究證明該菌株為國際上最新報(bào)道的新種坎皮納斯類芽胞桿菌，現(xiàn)報(bào)道如下?！就ㄓ嵶髡摺吭绬?，Email：byswshsh@wfmc．edu．cn，電話作者簡介】閻小芹（1979—），女（漢族），山東人，講師，現(xiàn)為濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院教師，主要從事病原生物學(xué)研究。E-mail:yxq0422@126.com；電話料和方法標(biāo)本采集：囑患者先排尿，消毒陰部，用滅菌紗布或棉球仔細(xì)擦拭尿道口，做前列腺按摩，收集前列腺液于滅菌試管內(nèi)。培養(yǎng)基及試劑：細(xì)菌分離培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基及底物利用試驗(yàn)培養(yǎng)基等均由濰坊醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室按常規(guī)配制。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。16SrDNAPCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。所用引物：利用一對16SrDNA-PCR通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')、1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')，由北京華大中生科技發(fā)展有限公司合成。涂片和染色鏡檢：取無菌留取的前列腺液直接涂片，革蘭染色后鏡下觀察。細(xì)菌分離培養(yǎng)與染色：取無菌留取的前列腺液分區(qū)劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)24～72h，對培養(yǎng)出的菌落取細(xì)菌涂片進(jìn)行革蘭染色、美藍(lán)及抗酸染色、芽胞、莢膜染色，鏡檢觀察。細(xì)菌的純培養(yǎng)：將分離培養(yǎng)出的可疑棒狀樣桿菌(記作0206#菌)分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和5%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24～72h觀察結(jié)果；接種細(xì)菌于半固體培養(yǎng)基，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24～72h觀察其動(dòng)力。生化試驗(yàn)：將純培養(yǎng)的棒狀樣桿菌分別接種于自制的糖發(fā)酵培養(yǎng)基、尿素及硝酸鹽培養(yǎng)基、醋酸鉛培養(yǎng)基，進(jìn)行葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、甘露糖、山梨醇、菊糖、木糖等產(chǎn)酸試驗(yàn)；尿素及七葉苷、酪素、淀粉水解試驗(yàn)；硝酸鹽還原試驗(yàn)；靛基質(zhì)試驗(yàn)；硫化氫試驗(yàn)等，測定觸酶、氧化酶活性。細(xì)菌基因組DNA的提?。喊凑照f明書步驟進(jìn)行。反應(yīng)體系(50μl)：10×Buffer(無Mg2+)5μl，10mMdNTP1μl，10μM引物(27f和1492R)各1μl，Taq酶1μl，模板DNA1μl，Mg2+6μl，ddH2O34μl。反應(yīng)條件：95℃5min；95℃35秒，57℃45秒，72℃130秒，29個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃20min。將PCR產(chǎn)物在1%普通瓊脂糖凝膠上電泳30min，電泳緩沖液為1×TAE，120V，EB染色25min后，紫外燈下觀察。16SrDNA測序及數(shù)據(jù)庫序列比對：將上述PCR產(chǎn)物送大連寶生生物有限公司測序，測序結(jié)果用GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLAST軟件進(jìn)行同源性比較。利用MEGA4軟件包構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果1．標(biāo)本涂片結(jié)果：鏡下可見有一定數(shù)量純的革蘭陽性棒狀樣桿菌(記作0206#菌株)，少許中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞。2．細(xì)菌形態(tài)及染色特性：涂片染色鏡檢可見單一的革蘭陽性桿菌，菌體細(xì)長，一端或兩端膨大呈棒狀，美藍(lán)染色可見深染的異染顆粒；不抗酸。無莢膜，可形成芽胞，散在或V字形排列。3．培養(yǎng)特性：細(xì)菌在血瓊脂平板上生長良好，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h可見白色針尖狀的不透明菌落，隨培養(yǎng)時(shí)間延長菌落增大，48h后可見白色不透明、無色素、有光澤、圓形凸起、邊緣光滑、表面濕潤的小菌落，直徑約1㎜。無β－溶血現(xiàn)象。在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長緩慢、貧瘠，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72h，始見灰白色針尖大小的不透明、干燥菌落。放37℃普通溫箱中培養(yǎng)亦能生長，但較5%CO2條件下生長緩慢。細(xì)菌有動(dòng)力，在半固體培養(yǎng)基中由穿刺線向四周呈云霧狀擴(kuò)散生長。4．生化反應(yīng)：能夠遲緩發(fā)酵蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、果糖、蜜二糖、核糖、山梨醇、塔格糖、木糖、阿洛酮糖產(chǎn)酸，不分解棉子糖、鼠李唐；不利用精氨酸、鳥氨酸、賴氨酸和硫氨酸；不利用乙酸鹽、檸檬酸鹽、丙二酸鹽、蘋果酸鹽和丙酮酸鹽；水解七葉苷，不水解明膠、酪蛋白和尿素；硝酸鹽還原酶陰性、觸酶和氧化酶陽性、Tween80酯酶陽性、淀粉水解試驗(yàn)陽性。5．16SrRNA基因序列(1420bp)測序結(jié)果：經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫BLAST序列比對顯示，該菌株與坎皮納斯類芽胞桿菌模式株(PaenibacillusCampinasensis菌株324T)的16SrDNA序列(GenBank注冊號AF021924)相似度為99．4％，僅存在9個(gè)核苷酸差異。在GenBank注冊的類芽胞桿菌屬菌種16SrRNA基因序列基礎(chǔ)上對其進(jìn)行種系發(fā)生初步分析，構(gòu)建該分離株(0206#菌株)與其系統(tǒng)發(fā)生最相近的菌種之間的Neighbour—Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。0206#菌株是在一個(gè)分枝的坎皮納斯類芽胞桿菌324T（AF021924）的不同菌株。圖1本研究分離株(0206#)與其密切相關(guān)菌種基于16SrRNA基因序列比對的Neighbour-joining系統(tǒng)發(fā)育樹討論類芽胞桿菌屬內(nèi)的細(xì)菌種類繁多，廣泛分布在沼澤地、荒漠地、鹽堿地土壤，植物根圍及廢水等處。臨床病例中很少見，近來偶有臨床報(bào)道從人體內(nèi)分離出類芽胞桿菌，Le?oRS等[1]從1例胰腺囊性纖維化患者的呼吸道分泌物中首次分離出P.cineris。儲(chǔ)從家等[2]從1發(fā)熱患者血液中檢出多粘類芽胞桿菌（P.polymyxa）。類芽胞桿菌在疾病中發(fā)揮的作用目前尚不明確。傳統(tǒng)上，由于缺乏精確的區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)，將所有需氧、可形成芽胞的桿菌都?xì)w入芽胞桿菌屬。這在很大程度上阻礙了新菌種的發(fā)現(xiàn)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)芽胞桿菌DNA的G+T含量為32--69mo1％，提示芽胞桿菌的廣泛性。16SrRNA基因測序以及先進(jìn)的表型檢測方法的實(shí)施(尤其是利用法國梅里埃生物公司的API50CH，APIZYM或APICoryne試劑盒進(jìn)行的生化反應(yīng)鑒定)，為類芽胞桿菌屬新菌種的鑒定提供了一個(gè)精確的體系。近幾年來即有多個(gè)新菌種被報(bào)道，如P.pinihumi[3]，P.harenae[4]，P.woosongensis[5]，P.zanthoxyli[6]，P.xinjiangensis[7]，P.gansuensis[8]，P.alkaliterae[9]等。正是利用16SrRNA基因測序以及API系統(tǒng)試劑盒表型檢測方法，Yoon等于1998年對從巴西土壤中分離出的一株芽胞桿菌進(jìn)行種系研究，根據(jù)其表型性狀及種系發(fā)生結(jié)果，將其鑒定為類芽胞桿菌，并且正式提出新種——坎皮納斯類芽胞桿菌（P.campinasansis）[10]。本研究菌株（0206#）的16SrDNA序列與模式株坎皮納斯類芽胞桿菌324T（AF021924)相比相似度達(dá)99.4％。根據(jù)細(xì)菌形態(tài)、生理和生化特征等表型性狀及16SrDNA序列分析，可初步確定該菌株為坎皮納斯類芽胞桿菌。但其生化特征與模式株相比亦存在明顯差異，如不能分解棉子糖產(chǎn)酸；能夠遲緩發(fā)酵蔗糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖產(chǎn)酸；不利用乙酸鹽、檸檬酸鹽、丙二酸鹽和丙酮酸鹽；不水解明膠、酪蛋白；硝酸鹽還原酶陰性、氧化酶試驗(yàn)陽性和Tween80酯酶陽性。初步考慮該分離株為坎皮納斯類芽胞桿菌的一個(gè)新亞型。在臨床感染病例中分離到坎皮納斯類芽胞桿菌，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。

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