細(xì)菌耐藥表型的檢測

細(xì)菌耐藥表型的檢測（一）1.葡萄球菌1.1對B-內(nèi)酰胺類藥物耐藥機制葡萄球菌對B-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥至少有三種不同的機制。①產(chǎn)生添加的青霉素結(jié)合蛋白PBP2a；②大量產(chǎn)生滅活藥物的B-內(nèi)酰胺酶；③內(nèi)源性的PBP被修飾（modifiedintrinsicPBPs,MOD-SA）降低了與藥物的親和力°PBP2a由mecA基因編碼，這個基因可能源自枯草桿菌，它所編碼的PBP2a不但不與B-內(nèi)酰胺類藥物結(jié)合，而且能替代幾種PBPs的功能，在細(xì)胞壁的合成中發(fā)揮轉(zhuǎn)肽酶作用。帶有mecA基因的菌株可以是同質(zhì)性的，在體外藥敏試驗中均表現(xiàn)耐藥；也可以是異質(zhì)性的，在體外試驗中僅1/104-108個菌表現(xiàn)耐藥。大量產(chǎn)生B-內(nèi)酰胺酶引起的耐藥，是由于酶打開藥物中的B-內(nèi)酰胺環(huán)，使藥物失去了與靶位（PBP）結(jié)合的能力，也稱做藥物被滅活oMOD-SA型耐藥是由于葡萄球菌原有的PBP1、2、4被修飾后降低了B-內(nèi)酰胺類藥物的親和力。表13-1耐B-內(nèi)酰胺類藥物的葡萄球菌的苯唑西林表型分類苯唑西林mecA基因機制borderlinea耐藥抑制劑作用B-內(nèi)酰胺類交叉耐藥其它藥物交叉耐藥R（同質(zhì)性）+PBP2a--++R（異質(zhì)性）+PBP2a土-++S-產(chǎn)生B-內(nèi)酰胺酶增加++--R/S-PBP1、2、4被修飾+---a：borderline耐藥表型：稀釋法中，苯唑西林MIC在2-8ug/ml之間，無明確終點；擴散法抑菌圈直徑10-13mm,邊緣不整齊。b：表示可以有例外情況實驗室檢測B-內(nèi)酰胺酶檢測采用酸法、碘法和頭抱噻吩（nitrocefin）法3種方法任一種均可。苯唑西林耐藥性檢測NCCLS推薦用瓊脂篩選法。我們的具體方法是配制含40g/LNaCl的MH瓊脂（加水量為應(yīng)加量的9/10）,高壓滅菌后分裝試管每管9ml,加蓋無菌橡皮膠塞后4°C保存。配制60pg/ml苯唑西林貯存液過濾除菌后分裝，每管1ml,-20°C保存（冰箱結(jié)冰室-18C左右亦可）半年內(nèi)有效。臨床用前將MH瓊脂隔水煮沸溶化，冷至50C以下，先將苯唑西林貯存液加入70mm直徑的平皿，再倒入MH瓊脂輕晃搖勻。將待測的金黃色葡萄球菌，調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝唬c種瓊脂后30C?35°C（不可超過35C）孵育24小時，有任何生長現(xiàn)象即為耐藥。本法目前只適用金黃色葡萄球菌。紙片擴散法檢測苯唑西林的耐藥性，方法同常規(guī)方法基本相同。不同處為:MH瓊脂中NaCl濃度為40g/L，金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)三13mm為敏感，11?13mm為中介，W10mm為耐藥；凝固酶陰性的葡萄球菌：218mm為敏感，W17mm為耐藥，注意要將平皿對著光線檢查抑菌圈內(nèi)是否有菌落生長。稀釋法也是在MH中加入40g/LNaCl，金黃色葡萄球菌：MICW2pg/ml為敏感，24pg/ml為耐藥；凝固酶陰性的葡萄球菌，MICW0.25pg/ml為敏感，三0.5pg/ml為耐藥。1.1.3試驗藥物的選擇和預(yù)報性在常規(guī)工作中，葡萄球菌對B-內(nèi)酰胺類藥物的藥敏試驗，可以只檢測青霉素、苯唑西林和氨芐西林/舒巴坦來判斷，如果能用硝噻吩法檢測快速P-內(nèi)酰胺酶最好。青霉素敏感的菌株表示對所有不耐酶的青霉素類藥物如氨芐西林、阿莫西林、羧芐西林、哌拉西林、替卡西林等均敏感，B-內(nèi)酰胺酶陽性或青霉素耐藥、氨芐西林/舒巴坦和苯唑西林敏感，表示對耐酶青霉素類藥物或青霉素類/酶抑制劑的復(fù)合制劑敏感。苯唑西林耐藥的葡萄球菌即目前被稱為MRS(耐甲氧西林的葡萄球菌)菌株，這種耐藥類型的細(xì)菌表示對所有的3-內(nèi)酰胺類藥物包括青霉素類、頭抱菌素類、3-內(nèi)酰胺類/酶抑制劑復(fù)合制劑、卡巴配能類均耐藥。而這些藥物在體外試驗中可顯示有活性，如果被誤報給臨床，可能會誤導(dǎo)臨床用藥。同時苯唑西林耐藥的葡萄球菌常常對紅霉素、氯林可霉素、氯霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、舊喹諾酮或氨基糖苷類耐藥。此外，苯唑西林敏感，而上述抗菌藥物出現(xiàn)較多交叉耐藥的菌株，也要考慮MOD-SA型的耐藥，提示臨床慎用表型為3-內(nèi)酰胺類敏感的藥物。對氨基糖苷類藥物耐藥機制細(xì)菌可以產(chǎn)生多種酶滅活氨基糖苷類藥物，這種滅活作用非常復(fù)雜，它們主要分為三大類：乙酰轉(zhuǎn)移酶(AAC)、核苷轉(zhuǎn)移酶(ANC)和磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)。每一類酶中又有許多亞類可以修飾不同位置上的羥基或氨基，導(dǎo)致不同的耐藥表型，在葡萄球菌中(也發(fā)現(xiàn)在腸球菌中)最重要的是aac(6')-Ie基因，編碼產(chǎn)生雙功能酶AAC(6')加APH(2”)。其APH(2”)部分可以修飾慶大霉素、妥布霉素和卡那霉素，AAC(6')部分可以修飾妥布霉素、奈替米星、卡那霉素和阿米卡星。因此這種雙功能酶實際使細(xì)菌對除鏈霉素以外的所有氨基糖苷類藥物耐藥。有些酶能催化修飾不同的氨基糖苷類藥物，但是由于酶對不同底物(藥物)的米氏常數(shù)(Km)不同，其催化效率的高低使試驗結(jié)果顯現(xiàn)不同的表型。如APH(3')-III可以修飾卡那霉素、奈替米星和阿米卡星，但在常規(guī)藥敏試驗中卻表現(xiàn)為對阿米卡星敏感，顯現(xiàn)錯誤的表型，除了產(chǎn)生滅活酶外，在金黃色葡萄球菌中也發(fā)現(xiàn)由于核糖體被修飾后導(dǎo)致的對鏈霉素的耐藥。(同腸球菌詳見本章2.2.1節(jié)。實驗室檢測及預(yù)報性對氨基糖苷類的耐藥性最好檢測其耐藥酶。臨床可用的氨基糖苷類藥物雖然并不多，但酶的種類、亞類卻非常之多，因而只能在少量參考實驗室進行此項工作。目前我們只能根據(jù)常規(guī)藥敏試驗中的某些表現(xiàn)推測其可能存在的耐藥機制，修改實驗室結(jié)果，預(yù)測臨床療效。下表列舉了最常見的幾種情況。表13-2葡萄球菌對氨基糖苷類藥物的耐藥預(yù)測表型推論機制預(yù)測耐藥KmRTmSGmSAkSAPH(3')KmRTmSGmSAKI/RKmRTmRGmSAkSANT(4')KmRTmRGmSAkI/RGmRAPH(2”)AAC(6')所有氨基糖苷類R(除鏈霉素外)Km:卡那霉素 Tm:妥布霉素Gm:慶大霉素AK:阿米卡星R：耐藥 I：中介 S：敏感1.3對糖肽類藥物已經(jīng)有人報道分離到對萬古霉素中等水平耐藥的葡萄球菌，這種耐藥的機制還不清楚，這些分離株的耐藥性并非從腸球菌中獲得對萬古霉素的耐藥基因所導(dǎo)致。但是已經(jīng)在實驗室條件下，應(yīng)用接合的方式將糞腸球菌對糖肽類藥物的高水平耐藥轉(zhuǎn)移給金黃色葡萄球菌，采用紙片擴散法檢測葡萄球菌對萬古霉素的耐藥，抑菌環(huán)直徑三15mm為敏感，W14mm的菌株應(yīng)該測MIC,當(dāng)檢驗到萬古霉素耐藥的葡萄球菌時，應(yīng)重新鑒定細(xì)菌和重復(fù)藥敏試驗，并送參考實驗室確認(rèn)。1.4對喹諾酮類藥物喹諾酮類藥物作用于細(xì)菌的DNA回旋酶（II型拓?fù)洚悩?gòu)酶）和IV型拓?fù)洚悩?gòu)酶，阻斷了細(xì)菌的生長和分裂，起到殺菌作用。當(dāng)編碼DNA回旋酶的gyrA基因和編碼IV型拓?fù)洚悩?gòu)酶的parC基因發(fā)生突變時，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥。細(xì)菌細(xì)胞膜通透性改變也可引發(fā)耐藥，這種耐藥通常伴有對結(jié)構(gòu)不相關(guān)藥物的耐藥，葡萄球菌對喹諾酮的耐藥往往是parC基因的突變，這種耐藥表型為對環(huán)丙沙星的耐藥。在葡萄球菌的藥敏試驗中，如果環(huán)丙沙星耐藥，可預(yù)測氧氟沙星，左旋氧氟沙星耐藥。細(xì)菌耐藥表型的檢測（二）2腸球菌2.1對B-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥耐藥機制腸球菌對B-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥可以是青霉素結(jié)合蛋白的改變，也可以是產(chǎn)生邛-內(nèi)酰胺酶。腸球菌自身的青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）與8-內(nèi)酰胺類藥物的親和力較低，青霉素對腸球菌的MIC通常三2pg/ml,而對鏈球菌的MIC通常W0.12pg/ml。腸球菌的這種天性，表現(xiàn)為對B-內(nèi)酰胺類藥物的“相對耐藥”而腸球菌對青霉素和氨芐西林的耐藥（MIC216pg/ml），是因為PBPs發(fā)生了改變，使親和力進一步降低。這種耐藥性屎腸球菌（MIC16?32pg/ml）比糞腸球菌（MIC2?4pg/ml）更為突出。p-內(nèi)酰胺酶形式的耐藥在腸球菌中非常少見，目前僅在糞腸球菌中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)B-內(nèi)酰胺酶的菌株。實驗室檢測采用常規(guī)紙片擴散法或稀釋法（肉湯稀釋法或瓊脂稀釋法）能檢測PBPs改變引起的耐藥，不能檢測產(chǎn)生p-內(nèi)酰胺酶引起的耐藥。稀釋法中要注意菌液濃度為107CFU/ml,比通常稀釋法中的菌液濃度高100倍。p-內(nèi)酰胺酶的檢測推薦使用頭孢硝噻吩法（見1.1.2節(jié)）。試驗藥物的選擇及其預(yù)報性僅P-內(nèi)酰胺酶陽性的腸球菌，預(yù)示對青霉素、氨芐西林、哌拉西林耐藥，而對泰能、P-內(nèi)酰胺類加酶抑制劑的復(fù)合藥物敏感。目前僅見到糞腸球菌P-內(nèi)酰胺酶陽性報導(dǎo)。血和腦脊液中分離的腸球菌檢測P-內(nèi)酰胺酶，可以盡早指導(dǎo)臨床用藥。p-內(nèi)酰胺類藥物中選擇青霉素和氨芐西林進行藥敏試驗即可。p-內(nèi)酰胺酶陰性、青霉素敏感的菌株對氨芐西林、阿莫西林、哌拉西林以及他們與酶抑制劑的復(fù)合制劑敏感。p-內(nèi)酰胺酶陰性、氨芐西林敏感的菌株預(yù)示對氨芐西林/克拉維酸以及阿莫西林/舒巴坦敏感。所謂對青霉素和氨芐西林“敏感”的分類，意味著對嚴(yán)重的腸球菌感染需要大劑量藥物治療。青霉素、氨芐西林耐藥的菌株，一般認(rèn)為是PBPs改變，泰能即使敏感也應(yīng)考慮耐藥。由腸球菌引起全身性嚴(yán)重感染（如心內(nèi)膜炎等），如果對高濃度氨基糖甙類敏感，而氨芐西林耐藥，應(yīng)該檢測氨芐西林的MIC,如果氨芐西林的MIC16?64ug/m1,仍可以考慮與氨基糖甙類聯(lián)合用藥（詳見下一節(jié)）。頭孢菌素類藥物不宜選擇進行腸球菌的藥敏試驗，因為其可以表現(xiàn)為體外試驗敏感，而臨床無效。對氨基糖甙類高水平耐藥耐藥機制一般不選用氨基糖甙類單一藥物治療腸球菌感染,因為氨基糖甙類藥物不易被攝入腸球菌，表現(xiàn)為內(nèi)源性、中等水平耐藥，MIC通常在8?256pg/ml。當(dāng)與作用于細(xì)胞壁的藥物如青霉素、氨芐西林、萬古霉素等聯(lián)合用藥,通過損傷細(xì)菌細(xì)胞壁,使氨基糖甙類藥物進入菌體，與細(xì)菌30S核糖體亞單位結(jié)合，干擾蛋白質(zhì)合成，發(fā)揮殺菌作用。一旦出現(xiàn)對氨基糖甙類高水平耐藥（慶大霉素的MIC2500pg/ml,鏈霉素21000》g/ml）,說明產(chǎn)生獲得性的耐藥。此時，對鏈霉素的耐藥是編碼細(xì)菌核糖體的基因發(fā)生了突變，由于靶位的改變藥物不能結(jié)合到作用部位，引起耐藥；對其它氨基糖甙類藥物的耐藥是獲得了新的基因，編碼產(chǎn)生修飾藥物的酶，使藥物滅活。實驗室檢測慶大霉素紙片含藥量120pg/片，鏈霉素紙片含藥量300pg/片，在MH瓊脂上進行KB法藥敏試驗，兩種藥物的判定界點一樣，即直徑210mm為敏感，7?9mm為中介，W6mm為耐藥。如果所測抑菌圈直徑為7-9mm,表示試驗無法定論，應(yīng)使用瓊脂篩選法或肉湯篩選法確定耐藥性。方法是配制慶大霉素含量500pg/ml的BHI肉湯或瓊脂，鏈霉素含量1000Mg/ml的BHI肉湯或2000pg/ml的BHI瓊脂，肉湯法的接種菌量如標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法，瓊脂法接種菌量為0.5麥?zhǔn)蠁挝?0ul菌液。35°C孵育，慶大霉素24h,鏈霉素24?48h（24h敏感繼續(xù)孵育至48h，出現(xiàn)生長現(xiàn)象（瓊脂法＞1個菌落）即為耐藥。質(zhì)控菌株有糞腸球菌ATCC29212（敏感株）和ATCC51299（耐藥株）。試驗藥物的選擇及其預(yù)報性在氨基糖苷類藥物中，腸球菌一般僅進行慶大霉素和鏈霉素高濃度藥敏試驗即可，其它氨基糖苷類的藥敏試驗，因為慶大霉素和鏈霉素對腸球菌的活性較同類其它藥物高。高濃度的慶大霉素或鏈霉素敏感預(yù)示著可以和作用于細(xì)胞壁的、藥敏結(jié)果敏感的青霉素類或糖肽類藥物（如氨芐西林、青霉素、萬古霉素等）協(xié)同用藥，高濃度的慶大霉素或鏈霉素耐藥，預(yù)示不可協(xié)同用藥。對糖肽藥物的耐藥耐藥機制腸球菌對糖肽類藥物的耐藥機制正被廣泛研究。對人類致病的腸球菌，對糖肽類藥物（萬古霉素、替考拉寧）的耐藥主要有VanA和VanB兩種表型，VanA型耐藥表現(xiàn)為對萬古霉素（MIC264Mg/ml）和替考拉寧（MIC216pg/ml）誘導(dǎo)型高水平的耐藥，但并不代表對其它抑制細(xì)胞壁合成的藥物耐藥。編碼VanA的基因攜帶在11Kb的轉(zhuǎn)座子Tn1546上，可以通過接合的方式在腸球菌間傳播高水平耐藥。在實驗室條件下，已成功地通過接合的方式將糞腸球菌對糖肽類藥物的耐藥轉(zhuǎn)移到金黃色葡萄球菌中。VanB型耐藥對萬古霉素呈現(xiàn)低至高水平耐藥（MIC16?512mg/ml）,通常對替考拉寧敏感。實驗室檢測可以采用紙片擴散法、稀釋法和篩選法檢測耐萬古霉素的腸球菌，前二種方法實驗操作同NCCL規(guī)定的一般細(xì)菌藥敏試驗檢測方法，擴散法中萬古霉素紙片為30pg/片，直徑三17mm為敏感，15?16mm為中介，W14mm為耐藥。替考拉寧紙片為30pg/片，直徑三14mm為敏感，11?13mm為中介，W10mm為耐藥。要注意測試萬古霉素的活性時，應(yīng)孵育24h,并用透射光檢查。在抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)薄霧狀或其它生長現(xiàn)象均表示耐藥。中介值的菌株要用稀釋法重新檢測。篩選法檢測萬古霉素耐藥的方法是：BHI瓊脂高壓滅菌后，冷至50°C以下，加入終濃度為6pg/ml的萬古霉素，傾注平板。然后在瓊脂表面點種0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木??10p1，35C24h，生長＞1個菌落即為耐藥，質(zhì)控菌株有糞腸球菌ATCC29212（敏感株）和ATCC51299（耐藥株）。檢測到萬古霉素耐藥的腸球菌，應(yīng)注意細(xì)菌的鑒定是否準(zhǔn)確，藥敏試驗中所用細(xì)菌是否為純菌，并最好重復(fù)測試一次。耐萬古霉素的腸球菌，不能用萬古霉素與氨基糖苷類藥物協(xié)同用藥，由于可選擇的藥物有限，可以加測氯霉素、紅霉素、四環(huán)素（或多西環(huán)素或米諾環(huán)素）以及利福平的敏感性，最好向有經(jīng)驗的傳染病專家咨詢治療方案。3.肺炎鏈球菌肺炎鏈球菌對青霉素的耐藥是因為青霉素結(jié)合蛋白的突變或多種PBP同時改變，如PBP2b、PBP2x、PBP1a。在B-內(nèi)酰胺類藥物中，只有苯唑西林可用紙片法檢測，其它p-內(nèi)酰胺藥物均無可靠的紙片擴散法藥敏試驗，它們的體外活性最好用稀釋法，苯唑西林的紙片擴散法用含5%羊血的MH瓊脂，1pg/片苯唑西林紙片，余同K-B紙片擴散法，抑菌圈220mm的菌株，報告青霉素敏感，并可以認(rèn)為對氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、頭孢克洛、頭孢地尼、頭孢吡肟、頭孢他美、頭孢克肟、頭孢噻肟、頭孢丙烯、頭孢布烯、頭孢三嗪、頭孢呋辛、頭孢泊肟、頭孢唑肟、亞胺培南、氯碳頭孢和美羅培南敏感，不需再做這些藥物的檢測。如苯唑西林抑菌圈W19mm,不能報告青霉素中介或耐藥，需要檢測青霉素和頭抱噻肟或頭抱三嗪的MIC。從重要感染部位如腦脊液、血液中分離肺炎鏈球菌要常規(guī)檢測青霉素和頭孢噻肟或頭孢三嗪的MIC。細(xì)菌耐藥表型的檢測（三）4.革蘭陰性細(xì)菌4.1對P-內(nèi)酰胺類藥物4.1.1耐藥機制在革蘭陰性細(xì)菌中，因為PBPs改變而導(dǎo)致的耐藥較少見，也有人報道在銅綠假單胞菌、淋病柰瑟菌、醋酸鈣不動桿菌等革蘭陰性細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)PBP的改變。產(chǎn)生各種不同的P-內(nèi)酰胺酶是許多革蘭陰性菌對P-內(nèi)酰胺類藥物耐藥的重要原因，以此還有降低了外膜的透入以及主動外流等耐藥機制。p-內(nèi)酰胺酶的分類方法很多，Bush根據(jù)酶的底物和抑制物輪廓（profile）以及分子結(jié)構(gòu)對p-內(nèi)酰胺酶進行的分類，是目前人們最普遍接受的分類方法（表13-3）。表13-3p-內(nèi)酰胺酶分類Bush組分子型分類最適底物代表酶1C頭孢菌素類AmpAmpC酶（革蘭陰性桿菌）2aA青霉素類青霉素酶（革蘭陽性菌）2bA青霉素類，頭孢菌素類TEM-1，TEM-2，SHV-12beA青霉素類，窄譜、超廣譜頭抱菌素，單環(huán)內(nèi)酰胺類TEM-3至TEM-26,SHV-2SHV62brA青霉素類TEM-30到TEM-362cA青霉素，羧基青霉素PSE-1，PSE-3，PSE-42dD青霉素，cloxaciHinOXA到OXA-11,PSE-2（OXA-2）2eA頭孢菌素普通變形桿菌誘導(dǎo)的頭孢菌素酶2fA青霉素，頭抱菌素，卡巴配能NMC-A（陰溝腸桿菌），Sme-1（粘質(zhì)沙雷菌）B多數(shù)B-內(nèi)酰胺類，包括卡巴配能L1（嗜麥芽窄食單胞菌），CcrA（脆弱擬桿菌）ND青霉素青霉素酶（洋蔥伯克霍德菌）TEM-1和SHV-1分別是大腸桿菌埃希菌和克雷伯菌中最常見的B-內(nèi)酰胺酶，它們由質(zhì)粒介導(dǎo)，能有效地水解青霉素類和窄譜頭孢菌素，但幾乎不能水解超廣譜的氧氨頭孢菌素（頭孢噻肟、頭孢他啶等）、頭霉菌素（頭孢西丁、頭孢替坦）、單環(huán)內(nèi)酰胺（氨曲南）和卡巴配能類（泰能和美平）。由TEM和SHV-型突變而產(chǎn)生的超廣譜B-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）主要存在于肺炎克雷細(xì)菌和大腸埃希菌，能夠水解超廣譜頭孢菌素和單環(huán)內(nèi)酰胺類藥物，但對酶抑制劑如克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦敏感。但是在1990年發(fā)現(xiàn)了由TEM-1突變產(chǎn)生的B-內(nèi)酰胺酶（非ESBL），對B-內(nèi)酰胺冷-內(nèi)酰胺酶抑制劑結(jié)合藥物的耐藥，它們在Bush分類中屬于2br組。ESBL突變不僅僅局限于TEM和SHV型酶，在銅綠假單胞菌中已經(jīng)檢測到由OXA型酶的突變株（2d組），它們對超廣譜頭抱菌素耐藥，通常不被克拉維酸抑制。幾乎所有的腸桿菌科細(xì)菌（除沙門菌屬、克雷伯菌屬）和銅綠假單胞菌都正常產(chǎn)生由染色體ampc基因編碼的AmpC酶（1組），它們是一種誘導(dǎo)型的酶，誘導(dǎo)機制還不十分清楚。可能在使用B-內(nèi)酰胺類藥物后，影響了細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，使胞質(zhì)中糖肽類降介產(chǎn)物堆積，使調(diào)節(jié)基因ampD突變，導(dǎo)致ampC變?yōu)榉€(wěn)定的去阻遏狀態(tài)，持續(xù)高水平產(chǎn)酶。在正常情況下，酶產(chǎn)量很低，當(dāng)存在B-內(nèi)酰胺誘導(dǎo)物時，產(chǎn)酶率可成百倍的升高。頭抱西丁、泰能和克拉維酸是較強的誘導(dǎo)劑。此外還有有酶活性中心需要金屬離子的金屬酶（3組）等。4.1.2實驗室檢測NCCLS推薦的ESBLs檢測方法可分為初篩試驗和表型確證試驗（國內(nèi)亦稱雙紙片增效法），可用于肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌和大腸埃希菌中ESBLs的檢測。初篩試驗方法同常規(guī)KB紙片擴散法，檢測紙片有頭抱他啶、頭抱噻肟、頭抱三嗪、頭抱泊肟和氨曲南。抑菌圈直徑出現(xiàn)頭抱他啶W22mm、頭抱噻肟W27mm、頭抱三嗪W25mm、頭抱泊肟W22mm、氨曲南W27mm時（只要有一種），即可疑有ESBLs產(chǎn)生。需做確證試驗才能報告結(jié)果。確證試驗方法也同KB法，選用兩對抗生素紙片，一對為頭抱他啶（30pg/片）和頭抱他啶/克拉維酸（30pg/10pg/片）；另一對為頭抱噻肟（30pg/片）和頭抱噻肟/克拉維酸（30pg/10ug/片）。2對中任何一對加克拉維酸的紙片比不加克拉維酸紙片抑菌圈直徑三5mm,即判為產(chǎn)ESBLs表型。質(zhì)控選用大腸埃希菌ATCC25922（加克拉維酸后的抑菌圈直徑比單藥增大W2mm）和肺炎克雷伯菌ATCC700603（頭抱他啶加克拉維酸抑菌圈直徑比單藥增大三5mm,頭抱噻肟加克拉維酸抑菌圈直徑比單藥增大23mm）。兩種復(fù)合藥物的紙片目前國內(nèi)尚無生產(chǎn)，英國Oxiod公司有產(chǎn)品出售。生物梅里埃公司Vitek系列可用GNS-NT藥敏卡或GNS-506藥敏卡檢測ESBLs（該卡目前設(shè)置0.5pg/ml頭抱他啶、0.5pg/4pg/ml頭抱他啶/克拉維酸和0.5pg/ml頭抱噻肟、0.5pg/4pg/ml頭抱噻肟/克拉維酸4個孔，能檢測出大多數(shù)產(chǎn)ESBLs的菌株）。無法開展以上確證試驗的實驗室，也可采用雙紙片擴散法。這種方法將阿莫西林/克拉維酸紙片貼在平皿中間，四周貼前面提到的篩選試驗的4?5種紙片，紙片間距常選20mm,當(dāng)阿莫西林/克拉維酸紙片與周圍任