羥自由基的新電化學(xué)檢測(cè)方法

羥自由基的新電化學(xué)檢測(cè)方法

在生物體內(nèi)，必要氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基可能會(huì)導(dǎo)致飽和脂肪酸的過氧化反應(yīng)、膜結(jié)構(gòu)的破壞和各種疾病。因此，羥基自由基的檢測(cè)對(duì)研究自由基的生物作用以及羥基自由基活性物質(zhì)的開發(fā)具有重要意義。羥自由基的檢測(cè)方法有電子自旋共振(ESR)、高效液相色譜(HPLC)和化學(xué)發(fā)光等。近年來二甲亞砜作為羥自由基的探針試劑的研究逐漸引起了人們的關(guān)注。作者基于Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基氧化二甲亞砜,產(chǎn)生的甲醛與乙酰丙酮、氨發(fā)生Hantzsch反應(yīng),產(chǎn)物3,5＿二乙?；?,4＿二氫吡啶在-1.20V(vsSCE)處有一靈敏的二階導(dǎo)數(shù)極譜波,建立了測(cè)定羥自由基及其清除的一種新電化學(xué)方法,測(cè)定了幾種清除劑的IC50(清除率為50%時(shí)清除劑的濃度)以及與羥自由基反應(yīng)的反應(yīng)速率常量,其結(jié)果與文獻(xiàn)值接近。該法儀器簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便,是一種值得推廣的測(cè)定羥自由基的方法。1實(shí)驗(yàn)部分1.1-edta-nh4ac-11的溶液MP＿1型溶出分析儀(山東電訊七廠),三電極系統(tǒng):滴汞電極為工作電極,飽和甘汞電極為參比電極,鉑絲電極為對(duì)電極。Fe(Ⅲ)-EDTA(摩爾比1∶1)溶液:0.004mol/L;DMSO:0.01mol/L;H2O2:0.006mol/L;NH4Ac:0.5mol/L,用0.5mol/LNaOH與0.5mol/LHCl調(diào)節(jié)pH為5.8;乙酰丙酮(0.4g/L):每天新配制;抗壞血酸(VC):0.012mol/L,每天新配制。實(shí)驗(yàn)室用水均為二次蒸餾水。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1b-6-甲基-1,4-二氫-3,5-o-edta摩爾比、5.在5mL的反應(yīng)溶液中,含KH2PO4-Na2HPO4(50mmol/L,pH7.4)、DMSO(200μmol/L)、Fe(Ⅲ)-EDTA(摩爾比1∶1,80μmol/L)、H2O2(120μmol/L)、VC(240μmol/L),混合溶液于37℃水浴反應(yīng)15min。1.2.2還原峰電流的測(cè)定上述溶液中加入4mLNH4Ac和1.5mL乙酰丙酮(0.4g/L),溶液最終pH為6.2,搖勻,于60℃水浴反應(yīng)20min,取出后流水冷卻,在示波極譜儀上,起始電位為-0.90V,在-1.20V處記錄二階導(dǎo)數(shù)還原峰電流。2結(jié)果與討論2.1羥自由基氧化對(duì)甲醛極譜圖的影響按實(shí)驗(yàn)方法繪制反應(yīng)產(chǎn)物的極譜圖如圖1所示。反應(yīng)產(chǎn)物在-1.20V處產(chǎn)生一靈敏的二階導(dǎo)數(shù)極譜波。在pH為6.2的NH4Ac溶液里加入適量的甲醛及乙酰丙酮,在60℃水浴中加熱20min后得到的極譜圖與本文提出的實(shí)驗(yàn)方法所得極譜圖相同說明被反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基氧化后產(chǎn)生了甲醛。降解反應(yīng)完成后加入乙酰丙酮直接測(cè)定,觀察不到相應(yīng)的極譜波,當(dāng)放置過夜或加熱后,才能在-1.20V處觀察到相應(yīng)的極譜波。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,該極譜波不是DMSO降解產(chǎn)物甲醛直接在滴汞電極上反應(yīng)而產(chǎn)生的,而是甲醛、氨和乙酰丙酮反應(yīng)生成的3,5＿二乙?；?,4＿二氫吡啶在滴汞電極上產(chǎn)生的四電子不可逆還原波。2.2試驗(yàn)條件的選擇2.2.1ph值的影響pH在4.3～7.2之間,峰電流隨pH升高逐漸增大,然后降低,當(dāng)pH=6.2時(shí),峰電流達(dá)到最大;峰電位Vp隨pH逐漸增加而線性負(fù)移,回歸方程為Vp=-0.77-0.065×pH,表明質(zhì)子參加了電極反應(yīng)(圖2)。2.2.2羥基自由基vc的用量VC在一定濃度下可將Fe(Ⅲ)-EDTA還原成Fe(Ⅱ)-EDTA,因而可以增加羥基自由基的產(chǎn)生量,但VC本身也是自由基的一種清除劑,如果用量過大,會(huì)造成自由基產(chǎn)生量的減少。實(shí)驗(yàn)選擇VC濃度為240μmol/L(圖3)。2.2.3o的加入Fenton體系自身可以產(chǎn)生H2O2,但額外H2O2的加入可以提高自由基的產(chǎn)生量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,H2O2的濃度大于80μmol/L時(shí)峰電流最大且基本穩(wěn)定,本實(shí)驗(yàn)選擇120μmol/L。2.2.4fe3+-edta溶液用量的確定改變Fe(Ⅲ)-EDTA(摩爾比1∶1)的用量,當(dāng)溶液中Fe3+-EDTA的濃度大于60μmol/L時(shí)峰電流達(dá)到最大且基本穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)選擇Fe3+-EDTA濃度為80μmol/L。2.2.5二苯基乙醇的使用0.4g/L的乙酰丙酮用量為1～2mL時(shí),峰電流達(dá)到最大且基本穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)選用1.5mL。2.2.6非mso時(shí)間限制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DMSO降解時(shí)間為12～25min時(shí)峰電流達(dá)到最大且基本穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)選用15min。2.2.7反應(yīng)時(shí)間及溫度Hantzsch反應(yīng)溫度在55～70℃、反應(yīng)時(shí)間在15～30min時(shí),峰電流達(dá)到最大且基本穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)分別選用反應(yīng)溫度為60℃,反應(yīng)時(shí)間為20min。2.2.8清除劑的穩(wěn)定性當(dāng)沒有清除劑存在時(shí),按實(shí)驗(yàn)方法,對(duì)于200μmol/LDMSO,5次測(cè)定的峰電流Ip(μA)為:6.1、6.4、6.3、6.3、6.5,RSD為2.4%。以葡萄糖為清除劑(1.6mmol/L),5次測(cè)定的峰電流Ip(μA)為:3.7、3.6、3.5、3.6、3.5,RSD為2.3%。可見,本法具有良好的精密度。2.3去除劑對(duì)羥自由基的去除作用2.3.1峰電流vdf在1.2.1的體系中加入一定量的清除劑,按1.2.2的方法測(cè)定-1.20V處峰電流。計(jì)算清除率(R)的公式為:R=(I0-I)/I0×100%,I0代表未加清除劑時(shí)的峰電流,I代表清除劑存在時(shí)的峰電流,以清除率對(duì)清除劑濃度作圖,得清除劑的IC50(見表1)。2.3.2反應(yīng)速率制度Halliwell等推導(dǎo)出了清除劑與羥自由基反應(yīng)的反應(yīng)速率常量KS的計(jì)算公式,以相同的方法可以得到下式:以1/I對(duì)清除劑濃度cS作圖,直線的斜率為KS/(KDMSOcDMSOI0)。Halliwell等采用DMSO與2＿脫氧D＿核糖