懷山藥種質(zhì)資源玻璃化超低溫保存技術(shù)研究

懷山藥種質(zhì)資源玻璃化超低溫保存技術(shù)研究

懷山藥又稱甘薯，是甘薯科的一種多年生包裹性藤本植物。主要產(chǎn)于河南省河南省徐州市的文縣、武干、濟(jì)陽等地（古懷慶地區(qū)管轄），具有良好的藥物和食物優(yōu)勢。入藥,具有健脾、補(bǔ)脾、固腎、益精、助五臟、強(qiáng)筋骨、益氣力之功效;食用,營養(yǎng)價(jià)值高,為滋補(bǔ)佳品,故素有“懷參”之稱,其產(chǎn)品不僅暢銷國內(nèi)各地,還遠(yuǎn)銷港澳地區(qū)和東南亞以及歐、美等地。目前對懷山藥主要開展了栽培管理、組織培養(yǎng)、藥用成分、加工工藝、藥理作用以及病毒病和脫毒快繁等一系列研究工作,而關(guān)于種質(zhì)資源則主要采用田間保存法,不僅需要大量的人力、物力和財(cái)力,而且還不可避免地受到病蟲害和各種自然災(zāi)害的影響。因此,進(jìn)行懷山藥種質(zhì)資源的離體保存研究就具有十分重要的意義。玻璃化法超低溫保存是植物細(xì)胞和組織長期穩(wěn)定保存的較好方法,可以節(jié)省空間,避免繼代、病蟲害和氣候等因素造成的種質(zhì)丟失,并且設(shè)備簡單,操作簡便,已經(jīng)成功地應(yīng)用于蘋果、甘薯、紫羅蘭等植物種質(zhì)資源的保存。有關(guān)山藥的超低溫保存國外已有研究,近年來本研究室對懷山藥種質(zhì)資源的超低溫保存也進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,本實(shí)驗(yàn)報(bào)道該研究的部分內(nèi)容。1材料和方法1.1材料試驗(yàn)材料為河南師范大學(xué)“四大懷藥”組織培養(yǎng)室繼代培養(yǎng)的B號懷山藥無菌苗。1.2超低溫保存技術(shù)以懷山藥帶芽莖段為材料進(jìn)行玻璃化法超低溫保存,并采用培養(yǎng)法檢測保存后材料的成活率,從而篩選出最佳的玻璃化法超低溫保存技術(shù)體系。該方法包括以下程序。1.2.1低溫訓(xùn)練繼代生長60d的懷山藥的試管苗分別置于4、7、9℃冰箱中低溫鍛煉0~30d。1.2.2培訓(xùn)在無菌條件下切取1~1.5cm的帶芽莖段,轉(zhuǎn)至含5%蔗糖+3%甘露糖的培養(yǎng)基內(nèi),置4℃冰箱預(yù)培養(yǎng)2d。1.2.3pvs1的測定本實(shí)驗(yàn)采用的玻璃化保護(hù)劑(PVS)是參考劉云國對蘋果莖尖進(jìn)行玻璃化超低溫保存的方法設(shè)置的PVS1。其主要成分為22%甘油+13%乙二醇+13%聚乙二醇+10%二甲基亞砜。預(yù)培養(yǎng)后的莖段先用60%的PVS1在0℃下處理60min,再用100%的PVS1在0℃下處理60min。1.2.4材料的冷凍儲存將玻璃化保護(hù)劑處理過的材料迅速放入液氮中,保存24h。1.2.5材料的冷凍清洗將材料從液氮中取出,采用37℃水浴快速化凍,化凍后用含1%~10%蔗糖的MS培養(yǎng)液洗滌4次,每次停留0~30min。1.2.6再生苗與常溫保存試苗的主要形態(tài)指標(biāo)和生理指標(biāo)將玻璃化超低溫保存化凍洗滌后的懷山藥莖段接種到再生培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),記錄成活率及恢復(fù)生長的時(shí)間,并在60d時(shí)測定超低溫保存后的再生苗與常溫保存試管苗的各項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)和生理指標(biāo)。成活率=玻璃化超低溫保存后成活的莖段數(shù)/保存的總莖段數(shù)×100%本試驗(yàn)均為單因子試驗(yàn),每次處理25個(gè)帶芽莖段,實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Dunnett法數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)中所使用的培養(yǎng)基均為MS+KT2mg/L+NAA0.02mg/L+3%蔗糖+0.5%瓊脂,培養(yǎng)溫度為(25±2)℃,光照14h/d。2結(jié)果與分析2.1低溫鍛煉時(shí)間取繼代培養(yǎng)60d的B號懷山藥,在4、7、9℃的低溫條件下分別鍛煉0、1、3、5、7、10、15、30d后,投入液氮保存,其凍后成活率見表1。從表1可以看出:(1)懷山藥莖段經(jīng)過一定時(shí)間的低溫鍛煉,其凍后成活率都比對照要高,并且隨著低溫鍛煉時(shí)間的延長,其成活率也得到不同程度的提高,當(dāng)?shù)蜏劐憻挄r(shí)間達(dá)到7d時(shí),成活率都達(dá)到最大。但當(dāng)?shù)蜏劐憻挸^7d時(shí),其成活率開始下降?？梢?懷山藥莖段的低溫鍛煉時(shí)間以7d為好;(2)低溫鍛煉溫度對懷山藥莖段凍后成活率也有顯著影響,在4℃低溫下進(jìn)行鍛煉后,懷山藥莖段的成活率都高于在7和9℃低溫下鍛煉的效果,而7℃低溫鍛煉的效果又優(yōu)于9℃低溫鍛煉的效果。在進(jìn)行懷山藥莖段的玻璃化超低溫保存時(shí),試管苗應(yīng)先在4℃低溫下鍛煉7d,這樣可獲得較高的成活率。2.2洗滌液和洗滌劑對懷山藥凍段成活率的影響玻璃化超低溫保存后的材料,用MS附加1%~10%蔗糖的洗滌液洗滌4次,每次洗滌0、1、3、5、7、10、15、30min,其洗滌后成活率見表2。從表2可以看出:(1)洗滌液蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對懷山藥的玻璃化超低溫保存有顯著影響。懷山藥莖段凍后的成活率隨蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而增大,當(dāng)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時(shí),成活率達(dá)到最大。但當(dāng)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過7%時(shí),其成活率則開始下降。可見,懷山藥莖段超低溫保存最佳的洗滌液以MS+7%蔗糖為好;(2)洗滌時(shí)間對懷山藥凍后成活率也有顯著影響,其中以每次洗滌10min的效果最好,懷山藥莖段成活率可達(dá)76.99%?？梢?在進(jìn)行懷山藥莖段的玻璃化超低溫保存時(shí),應(yīng)用MS+7%蔗糖洗滌4次,每次洗滌10min,這樣可獲得較高的成活率。2.3再生苗的形態(tài)測定將經(jīng)過玻璃化超低溫保存后的懷山藥帶芽莖段與常溫保存的懷山藥帶芽莖段同時(shí)接種到培養(yǎng)基上,前者10d開始恢復(fù)生長,15d莖段開始長出新芽,20d長出新葉,而后者7d即可恢復(fù)生長,13d長出新芽,18d長出新葉。60d時(shí)測定再生苗的形態(tài)指標(biāo),結(jié)果見表3。從表3可以看出,超低溫再生苗與常溫苗的形態(tài)指標(biāo)基本一樣,經(jīng)Dunnett法檢驗(yàn),其株高、葉片數(shù)、芽數(shù)和莖節(jié)長雖有差異,但未達(dá)顯著水平。2.4b號懷山藥超低溫再生苗的生理生化指標(biāo)將經(jīng)過玻璃化超低溫保存后的B號懷山藥帶芽莖段與常溫保存的B號懷山藥帶芽莖段同時(shí)接種到培養(yǎng)基上。60d時(shí)測定再生苗和常溫苗的生理生化指標(biāo),結(jié)果見表4。從表4可以看出,B號懷山藥超低溫再生苗與其常溫苗的生理生化指標(biāo)基本一樣,經(jīng)Dunnett法檢驗(yàn),其葉綠素和可溶性蛋白的量以及POD活力雖有差異,但未達(dá)到顯著性水平。結(jié)合表3可以知道,玻璃化超低溫保存技術(shù)用來保存懷山藥種質(zhì)資源是合適的,能夠保證遺傳資源的穩(wěn)定性。3在不同的溫度下材料在植物種質(zhì)資源超低溫保存過程中,低溫鍛煉和預(yù)培養(yǎng)是保證成活率的重要步驟。低溫鍛煉可提高植物體內(nèi)脯氨酸、多胺的量及胞液的滲透勢等,從而增加植物的抗凍性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在懷山藥莖段的玻璃化超低溫保存中,4℃低溫處理效果最好。可見,低溫鍛煉可以提高懷山藥帶芽莖段的耐凍力。劉云國等將培養(yǎng)60d的蘋果無菌苗分別轉(zhuǎn)入0~7℃下,培養(yǎng)1~42d,發(fā)現(xiàn),隨著低溫鍛煉時(shí)間延長,存活率增加,但28d之后存活率基本保持不變,不同的低溫(0~7℃)處理中,4℃處理得到最高的存活率;周小梅等將玉米幼胚在4℃冰箱中放置7d也獲得較好的效果,玻璃化超低溫保存后能誘導(dǎo)出良好的愈傷組織;趙艷華等認(rèn)為馬哈利櫻桃離體莖尖隨低溫處理時(shí)間的延長,其凍后存活率逐漸提高,與CK相比,處理90d的材料玻璃化超低溫保存后莖尖存活率提高了60.8%。對于玻璃化超低溫保存材料,化凍后的洗滌被認(rèn)為很重要,這一過程不僅可除去高含量玻璃化保護(hù)劑對細(xì)胞的毒性,而且也是一個(gè)后過渡,以防滲透損傷,影響材料恢復(fù)和繼續(xù)生長,因此需要除去玻璃化保護(hù)劑。陳勇等發(fā)現(xiàn),用含1.2mol/L山梨醇的MS培養(yǎng)基對胡蘿卜懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和原生質(zhì)體進(jìn)行洗滌能減輕細(xì)胞的復(fù)水損傷,提高其存活率。本實(shí)驗(yàn)也表明,懷山藥莖段經(jīng)玻璃化超低溫保存后,用MS+7%蔗糖的培養(yǎng)液洗滌4次,每次洗滌10min,存活率顯著提高,達(dá)75%~77%。這是因?yàn)檎崽琴|(zhì)量分?jǐn)?shù)過低、洗滌時(shí)間過短或不洗滌,容易導(dǎo)致玻璃化保護(hù)劑對懷山藥莖段細(xì)胞的傷害,而蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高或洗滌時(shí)間過長,則容易損傷細(xì)胞,這可能與質(zhì)壁分離和溶質(zhì)平衡失調(diào)有關(guān)。但在某些材料研究中發(fā)現(xiàn),玻璃化超低溫保存后的材料不經(jīng)洗滌