bb基因診斷、治療

基因診斷與基因治療

GeneDiagnosisandGeneTherapyLaboratoryofMolecularVirology,InstituteofVirology,WuhanUniversitySchoolofMedicine9/17/20231第一節(jié)基因診斷（genediagnosis）一、定義：Definitionofgenediagnosis

基因診斷：用分子生物學(xué)技術(shù)對導(dǎo)致疾病的原因進(jìn)行病原學(xué)和細(xì)胞遺傳基因的檢測分析,從而對相應(yīng)疾病進(jìn)行診斷。

Geneticdiagnosisisatestusingmolecularbiologytechnologiestoseekthecausesofdiseasesthroughanalysisofpathogensandgenes.9/17/20232基因診斷的靶分子是基因。

Thetargetsofgenediagnosisaregenes9/17/20233傳統(tǒng)的疾病診斷：Conventionaldiagnosticapproaches

細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量celluarmorphology&celluarquantity生化反應(yīng)、酶活性biochemicalreaction,activitiesofenzymes

免疫學(xué)檢驗(yàn)Immunologictests

9/17/20234檢測表型或形態(tài)學(xué)改變

detectionofphenotypicormorphologicfeatures

檢測對象是基因的產(chǎn)物--蛋白質(zhì)、多肽。Detectionobjectsareproductsofgenes,suchasprotein,polypeptide

9/17/20235二、基因診斷常用的技術(shù)：

Technologiesincommonuse

分子雜交技術(shù)(Nucleicacidmolecularhybridization

)PCR技術(shù)(Polymerase-Chain-Reaction)3.以上二者的衍生技術(shù)（包括DNA芯片

）derivativetechnologiesfromabovetwotechnologies,DNA-Chips4.DNA序列測定DNAsequencing

9/17/20236基因診斷獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：Advantagesofgenetherapy

從分子水平上找到特異的致病基因Tofindpathogenicgenes

atthemolecularlevels

具有很高的靈敏度Highsensitivity

9/17/20237獲得穩(wěn)定的結(jié)果StableResults

核酸比蛋白質(zhì)穩(wěn)定Nucleicacidismorestablethanthatofprotein.快速、早期診斷技術(shù)Speedy&early

甚至在未出現(xiàn)癥狀的情況下早期診斷應(yīng)用廣、適用性強(qiáng)Wideapplicability9/17/20238三、基因診斷策略Strategiesforgenetherapy（一）通過致病基因的檢測診斷疾病Diagnosisofdiseasesviapathogenicgenes

9/17/20239基因的結(jié)構(gòu)清楚、突變點(diǎn)明確、致病機(jī)制基本清楚。Structure,mutation

andpathogenicmechanismofpathogenicgenesareclearlyunderstood.9/17/2023109/17/2023111)單基因遺傳病eg.monogeneticorsingle-genedisease

鐮狀細(xì)胞貧血Sicklecellanemia

→珠蛋白基因globingene

Codon6GAG→GTGA-T突變(mutation)谷氨酸(glutamic)→纈氨酸(valine)

9/17/2023122)、Gene缺失遺傳病的診斷1)α地貧的Gene診斷α基因不同程度的缺失引起不同類型的α地貧，α基因缺失1～4個(gè)。正常Gene組用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一個(gè)αGene時(shí)可得到10kb片段。BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe9/17/202313以αGene為探針，Southernblot方法檢測αα/αααα/α-αα/--α-/----/--

正常缺1缺2缺3缺414kb10kb9/17/2023143)DMD/BMD的缺失診斷

（進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良或假肥大型）DMD是一種嚴(yán)重致死性疾?。╔R），臨床癥狀表現(xiàn)肌肉進(jìn)行性萎縮和乏力。BMD臨床癥狀與DMD相似，但癥狀較輕。Gene定位Xp21，Gene2300kb,79個(gè)Exon，cDNA全長13974bp編碼3685Aa，分子量427kD。DMD/BMD70%左右為缺失型，基因很大，缺失可能發(fā)生在不同的部位。應(yīng)用多重PCR擴(kuò)增檢測，判斷缺失狀態(tài)。9/17/202315（二）通過連鎖遺傳標(biāo)志檢測診斷疾病Diagnosisvialinkagegeneticmarker

基因結(jié)構(gòu)、突變情況不清楚，但已知定位在染色體的特定位置上。Chromosomelocationofpathologicgenesisclear,butthestructureandmutationofthegenesareunclear.

9/17/202316同一染色體上位置十分靠近的基因或其他遺傳標(biāo)志,常常一起遺傳,形成連鎖（linkage）.Thegenesorothergeneticmarkerslocatednearatthesamechromosomecanbeinheritedtogether,andtoformlinkage.9/17/202317例如：具體基因不明的遺傳病Hereditarydiseasecausedby

unidentifiedgenes用內(nèi)切酶切正常母親DNA，雜交后出現(xiàn)7.6kb帶；同酶同方法檢查有遺傳病的父親，發(fā)現(xiàn)6.0和7.6kb兩種片斷，表明6.0kb與基因病有連鎖關(guān)系。這樣當(dāng)胎兒羊水或胚胎絨毛細(xì)胞同樣處理后，僅出現(xiàn)7.6kb片段，表明胎兒正常，如果同時(shí)有6.0和7.6時(shí)，表明胎兒攜帶有父親的遺傳病基因。

9/17/2023181、Gene異常不明確的遺傳病的診斷例：成年型多囊腎病——APKD，AD，臨床表現(xiàn)為腰痛，蛋白尿，血尿，高血壓，腎盂性腎炎，腎結(jié)石。最終導(dǎo)致腎功能衰竭和尿毒癥。APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和疾病發(fā)病機(jī)理也尚未闡明，但已證實(shí)APKDGene與α珠蛋白基因3`端附近的一段小衛(wèi)星DNA序列（3`HVR）緊密連鎖，因此，可以通過RFLP連鎖分析進(jìn)行診斷。9/17/202319

以3`HVR為probe與PvuII酶切后的家系有關(guān)成員的Gene組DNA雜交——SouthernBlot雜交Gene組DNAprobe（3`HVR）PvuII酶切

DNA片段

雜交結(jié)果9/17/202320

英國女王維多利亞。她帶有血友病的基因，并將其傳給了她的兒女。血友病是一種遺傳性凝血障礙疾病，患者可能因很小的傷口而出血不止導(dǎo)致死亡。血友病在女性一般表現(xiàn)為隱性遺傳，較少發(fā)病，但會傳給后代；在男性則表現(xiàn)為顯性遺傳，顯示出病癥。維多利亞女王在科堡主持的一次歐洲王室成員集會，與會者有17人是她的后裔，其中有她的孫女亞歷山德拉（21），她同俄國沙皇尼古拉二世結(jié)婚，導(dǎo)致他們的兒子患有血友病。9/17/202321PCR—RFLP診斷甲型血友病的基因診斷，已知甲型血友病XR，獲得家系成員基因組DNA。PCR142bpBcLI

142bp99bp43bp電泳結(jié)果分析？p1p2142bp99bp43bpBclIBclI-BclI+9/17/202322問:1/Ⅱ2、Ⅲ1診斷；2/Ⅲ1是男或是女發(fā)病？

142bp99bp12123ⅠⅡIII19/17/202323結(jié)果分析1）先癥者II2具有99bp片段而發(fā)病，該片段來自母親。2）II2有142bp/99bp雜合子。142bp來自父親，為正常片段，99bp片段是來自母親而成為攜帶者。3）Ⅲ1為99bp片段如果是男性為患者（99bp片段來自母親）；女性為攜帶者（來自父母雙方）9/17/202324連鎖分析(geneticlinkageanalysis

)就是在家系成員中尋找患病成員共同具有的比正常成員出現(xiàn)頻率更高的染色體片段.Thesearchforcertain

chromosomefragmentsthatarefoundinpeoplewithadisorderaremorefrequentlythanyouwouldexpectinpeoplewithoutthedisorder.

9/17/202325在這個(gè)區(qū)域內(nèi)具有疾病傾向的基因Thegenewithsusceptibilitytodiseaseislocatedintheregion.9/17/202326遺傳標(biāo)記選擇Geneticmarkerselection

：多標(biāo)記原則Mult-markerprinciple靠近原則Convergenceprinciple9/17/202327不是尋找DNA缺陷(DNAdeficiency),而是通過分析DNA遺傳標(biāo)記多態(tài)性來判斷被檢者是否具有帶致病基因的染色體,判斷被檢者患病的可能性Itisananalysisofpolymorphismofgeneticmarkertodecidewhetherthechromosomeiscarryingthepathogenicgene,butnotasearchforDNAdeficiency.9/17/202328（三）通過基因表達(dá)的定量分析診斷疾病Diagnosisofdisordersviaquantitativeanalysisofgeneexpression基因表達(dá)水平的變化,可引起相應(yīng)蛋白質(zhì)的含量變化。variationin

geneexpressionlevelsisrelatedtovariationin

itsproteinlevels

9/17/202329定量PCR技術(shù)可用于基因診斷，也可用于治療效果監(jiān)控。Applicationofreal-timepolymerasechainreactiontogenediagnosisandmonitoringoutcomeoftherapy9/17/2023309/17/202331四、基因診斷存在的問題及前景Problemsandprospects

inthegenediagnosis1、理論問題theoryproblems.9/17/202332已找到的致病基因不多，弄清機(jī)制的就更少?；蛟\斷失去了基礎(chǔ)。Littleisknownaboutpathogenicgenes,andlessisknownaboutthemechanism.Genediagnosislosesitsfoundation9/17/2023332、技術(shù)問題technicalproblems

對設(shè)備及條件要求高、所需試劑價(jià)格昂貴。highrequirementsforequipmentsandconditions&highexpenseforessentialregents

9/17/202334技術(shù)復(fù)雜、精細(xì)，對操作人員的要求高。Thevarietyandcomplexityoftechnologyhasalsogrownandweneedaprofessionthatdealswiththissituation9/17/202335技術(shù)靈敏度高，很容易受到污染而出現(xiàn)假陽性。Falsepositiveresultsmaybeobtainedbycontaminationduetothehighsensitivityoftechniques

.9/17/2023363、倫理問題ethicalconcerns

可能引起基因歧視（Itmaycauseageneticdiscriminationbygenediagnosis）

9/17/2023379/17/202338基因診斷的發(fā)展前景Futureprospectsforgenediagnosis

呈現(xiàn)十分廣闊的應(yīng)用前景，發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

genediagnosishasawideapplicationandagreatpotentialinfuture.9/17/202339五、已進(jìn)行基因診斷的遺傳病Inheriteddisordersdetectedbygenediagnosis（一）血紅蛋白病（hypochromia）鐮狀細(xì)胞貧血（sicklecellanemia）→珠蛋白基因globingeneCodon6GAG→GTGA-T突變谷氨酸(Ghe)→纈氨酸（vol）

9/17/202340α（β）地中海貧血α（β）MediterraneanSeaanemia

α（β）珠蛋白基因缺失，珠蛋白mRNA含量減少，珠蛋白α（β）鏈合成不平衡。Defectinα（β）globin,andreductionofglobinmRNAproduction,whichleadstoanimbalanceinα:βchainratio.9/17/202341診斷Diagnosis：PCR-ASO（allelespecificoligonucleotide,ASO)9/17/202342定性分析(qualitativeanalysis)：PCR定量分析(quantitativeanalysis)

：實(shí)時(shí)定量RT-PCRReal-timequantitativePCRassay

9/17/202343杜氏肌營養(yǎng)不良（Duchennemusculardystrophy,DMD)---性連鎖隱性遺傳病（Sex-LinkedRecessiveInheritance），抗肌萎縮蛋白（dystrophin）基因突變所致DuchenneMuscularDystrophyiscausedbythegenemutationofdystrophin.9/17/202344苯丙酮尿癥（phenylketonuria，ＰＫＵ）－－常染色體隱性遺傳氨基酸代謝病autosomalrecessivegeneticdisorders

ofaromaticaminoacidmetabolism

苯丙氨酸羥化酶基因突變phenylalaninehydroxylasegenemutation丙氨酸羥化酶缺乏phenylalaninehydroxylasedeficiency9/17/202345

脆性Ｘ綜合癥fragileXsyndromeFMR-1基因的微衛(wèi)星序列（CGG）n改變，導(dǎo)致功能變異。ThemutationinCGGrepeatofFMR1geneleadstoalteredfunction.9/17/202346可通過檢測串聯(lián)重復(fù)序列的長度來進(jìn)行。Wecanexaminethediseasebydetectingthelengthoftandemrepeatsequences.9/17/202347

基因診斷技術(shù)檢測腫瘤Therolesofgenediagnosistechnologyindetectionofcancer１）腫瘤的早期診斷和預(yù)警診斷Earlydiagnosis&earlywarningoftumours9/17/202348２）高危（易感）人群篩查及危險(xiǎn)性評估Screenforhighriskorsusceptiblegroup&RiskAssessment

9/17/202349３）腫瘤鑒別診斷、分期、預(yù)后判斷Distinctivelydiagnosis,stagingandprognosis４）微小轉(zhuǎn)移灶識別Detectionofmicrometastases

9/17/202350５）治療效果監(jiān)測及評價(jià)Assessment&surveillanceof

therapyeffects9/17/202351對不同腫瘤、不同目的，采取不同的基因診斷策略

Differentstrategiesfor

differenttumorcells,

differentpurposes9/17/202352腫瘤基因診斷主要策略有Mainstrategiesforidentifyinggenesinvolvedintumours檢查腫瘤染色體易位及融合基因Detectionofchromosometranslocation&fusiongenes

9/17/202353檢查癌基因與抗癌基因Detectionofoncogenes&tumorsuppressorgenes9/17/202354檢測腫瘤相關(guān)基因Detectionoftumor-relatedgene

檢測腫瘤標(biāo)志物或mＲＮＡ等DetectionofmarkersandmRNAoftumor9/17/202355基因診斷技術(shù)檢測感染性疾病Genetherapytechnologies

inthediagnosisofinfectiousdiseases

細(xì)菌、病毒、寄生蟲感染(infectionofbacteria,virusandparasite）9/17/2023569/17/202357第二節(jié)基因治療（genetherapy）是現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與醫(yī)學(xué)學(xué)科交叉滲透而形成的一個(gè)全新治療領(lǐng)域。Genetherapyisanewcross-discipline,whichcoverstechnologiesinmodernmolecularbiologyandmedicalscience.9/17/2023589/17/202359基因治療早期是將目的基因?qū)氚屑?xì)胞內(nèi)，成為宿主細(xì)胞遺傳物質(zhì)的一部分，Earlypurposeofgenetherapyistomaketargetgenesbecomeapermanentpartofthehostcell'sgeneticmaterialbyinsertingtheirgeneticmaterialintothechromosomesofhostcells.

9/17/202360目的基因的表達(dá)產(chǎn)物對疾病起治療作用。

Therapeuticeffectofexpressionproductsofgenesofinterestondiseases.9/17/202361現(xiàn)在:將正?；?qū)氩∽兗?xì)胞中，替代或與缺陷基因共存，產(chǎn)生正常表達(dá)產(chǎn)物補(bǔ)充缺陷蛋白質(zhì)Delivernormalcopyofageneintopathologicalcellstosupplementtheproteinthatarenotexpressingenough.9/17/202362抑制細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)的基因；Delivernucleicacidthatwillinactivateanover-expresseddeleteriousprotein.9/17/202363將特定基因?qū)敕遣∽兗?xì)胞，在體內(nèi)表達(dá)特定產(chǎn)物；andtransfergivengeneintonormalcellstoletitexpressgivengeneproducts.9/17/202364向功能異常細(xì)胞中導(dǎo)入該細(xì)胞中本來不存在的基因，利用表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。addafunctionalcopyofthetherapeuticgenetocellswithdysfunctionthatoriginallydonotexpressit.

利用基因產(chǎn)生治療效應(yīng)。andmakeuseofgenestoproducethetreatmenteffect9/17/202365第一節(jié)基因治療策略

Strategiesforgenetherapy基因置換（gene

replacement）或基因矯正（gene

correction）－－將特定目的基因?qū)胩囟?xì)胞置換原有的缺陷基因。

Anormalcopyofagenemaybeintroducedintocellstoreplaceadefectivecopy.9/17/202366必要條件是：Essentialconditions對導(dǎo)入的基因及其產(chǎn)物有詳盡的了解.Fullunderstandingaboutthetransferredgeneanditsgeneproductisessential.能有效的導(dǎo)入靶細(xì)胞Theabilityofbeing

transferredefficientlyintotargetcells

在靶細(xì)胞中長期穩(wěn)定存在Long-termandstablegeneexpressionintargetcellsisdesired.9/17/202367導(dǎo)入基因有適度水平的表達(dá)Keepingtransferredgeneexpressingatamoderatelevel.導(dǎo)入方法及載體對細(xì)胞無害Themethodsofgenetransferandvectorsmustbeharmlesstothetargetcells.9/17/202368一般采用同源重組技術(shù)（homologousrecombination）又稱基因打靶（genetargeting）Generallyadoptthistechniqueofhomologousrecombination,genetargeting.9/17/2023699/17/2023709/17/202371２.基因替代(genereplacement)、基因添加(geneaddition)、基因補(bǔ)充(genesupplement)、

.9/17/2023721)針對特定的缺陷基因,導(dǎo)入相應(yīng)的正常基因(缺陷基因并未除去)Transferafunctionalcopyofthegeneintotargetcellsbyaimingataparticulardefectgene

(andthedefectedgenecanbekept).2)導(dǎo)入靶細(xì)胞本來不表達(dá)的基因(將細(xì)胞因子導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞)Transfertheinterestgeneintotargetcellsthatareoriginallynotexpressingthegeneproduct(bygettingcytokineintotumorcells)9/17/2023733.基因干預(yù)(geneinterference)

采用某些方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)或通過破壞某個(gè)基因的結(jié)構(gòu)使之不能表達(dá),達(dá)到治療目的.Toattainthetreatmentpurpose,geneinterferenceiseithertoextinguishexpressionfromthemutationalleleorbreakthestructureofacertaingene.9/17/202374三種策略是以恢復(fù)細(xì)胞正常功能或干預(yù)細(xì)胞功能為目的.Thepurposeofabovethreestrategiesistoresumethenormalfunctionorintervenethefunctionofcells.9/17/2023754.細(xì)胞自殺效應(yīng)Suicidegenetherapy

通過導(dǎo)入自殺基因,誘發(fā)細(xì)胞自殺效應(yīng)也是重要的治療策略.Inductionofsuicideeffectviadeliveryof“suicide”genesintotargetcells,suchastumorcellsisalsoanimportanttreatmentstrategy

9/17/202376自殺基因是病毒、細(xì)菌等原核生物中具有特殊功能的酶類基因，此類基因轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞后產(chǎn)生的酶能將無毒或毒性極低的藥物前體轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒性代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞自殺，因此又稱為病毒導(dǎo)向酶解藥物前體療法(VDEPT).9/17/2023779/17/2023785、基因修飾(genemodification)也屬于基因添加，但目的不是修復(fù)、改善細(xì)胞功能，而是改變細(xì)胞功能。9/17/2023791）基因修飾腫瘤細(xì)胞的“疫苗”療法：將IL-2、TNF-導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，誘發(fā)抗腫瘤細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞反應(yīng)；另分泌的細(xì)胞因子增強(qiáng)CTL和效應(yīng)細(xì)胞反應(yīng)。9/17/2023802）基因修飾TIL的過繼療法：將細(xì)胞因子導(dǎo)入腫瘤侵潤淋巴細(xì)胞中，使TIL具有更強(qiáng)的抗腫瘤作用9/17/2023813）免疫增強(qiáng)基因療法：將MHC-I類基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，增加其免疫原性。9/17/202382

第二節(jié)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)Genetransfertechnologies

基因治療方式有兩種：Mannersofgenetherapy1）體內(nèi)法（invivo）2）回體法（exvivo）9/17/202383CellsremovedfrombodyTransgenedeliveredCellsculturedCellsreturnedtothebodyExVivoInVivoTransgenedelivereddirectlyintohostStrategiesforTransgeneDelivery9/17/202384invivo

即將外源性功能基因以逆轉(zhuǎn)錄病毒、質(zhì)粒載體或脂質(zhì)體類包囊，或以裸露DNA的形式直接注入體內(nèi)，讓基因在體內(nèi)表達(dá)。Amethodoflettingaforeignfunctionalgeneexpressinvivobytransferofretrovirusvector,plasmidvector,liposomeorthedirectinjectionof'nude'DNA.

9/17/202385exviro即將受體細(xì)胞（例如淋巴細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、皮膚或纖維細(xì)胞等）在體外培養(yǎng)導(dǎo)入外源性功能基因，然后把這種經(jīng)遺傳修飾的受體細(xì)胞輸回或移植入患者體內(nèi)，讓外源基因表達(dá)。Amethodoflettingaforeignfunctionalgeneexpressbytransferringthegeneintotargetcells(eg.Lymphocytes,hematopoieticstemcells,skinorfibercells,etc.)culturedexviro,andthentransfusingortransplantingthegeneticmodifiedcellsintothepatientbody.

9/17/2023869/17/2023879/17/202388基因治療必須通過適當(dāng)?shù)幕蜣D(zhuǎn)移(genetransfer)技術(shù),將外源基因轉(zhuǎn)移至特定細(xì)胞內(nèi).Genetherapyreliesintheconceptthat“foreign”genesmaybetransfertotargetcellsusingappropriategenetransfertechnologies9/17/202389基因轉(zhuǎn)移技術(shù)有兩大類Methodsofgenedelivery:生物學(xué)方法Biologicalmethods(病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)Viralmethods)非生物學(xué)方法Non-Biologicalmethods

(物理或化學(xué)方法PhysicalorChemicalmethods)9/17/202390逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(retrovirusvector)是基因治療中最常用的載體,轉(zhuǎn)移效率較高.Themostcommonvirusvectorsthatareusedingenetherapyareretrovirusvectors一、基因轉(zhuǎn)移生物學(xué)方法Biologicmethodsofgenetransfer9/17/2023919/17/202392基因組是二倍體ss+RNAThegenomeisdiploid.類似真核mRNA，similarinstructuretoeucaryoticmRNA

5`端帽狀結(jié)構(gòu)，5`cappingstructure

3`端多聚A尾,3`poly-Atail9/17/202393前病毒基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：Charactersofprovirusgenome

1)兩端各有一長末端重復(fù)序列LTR（由U3、R、和U5組成），LTR中含有啟動子、增強(qiáng)子、加尾信號。Alongterminalrepeat(LTR)ofendogenousretrovirusislocatedateitherendofgenome(composeofU3,RandU5).LTRcontainstheelementsincludingpromoter,enhancerandtailingsignal.

9/17/202394

是病毒整合進(jìn)細(xì)胞基因組的過程的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。Itisthekeystructurefortheintegrationofviralgenomeintothechromosomeofhostcells,formingtheprovirus.

9/17/2023952）有三個(gè)結(jié)構(gòu)基因:gag、plo和envItcontains3structuregenes,gag,ploandenv

分別編碼核心蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶和外殼（包膜）糖蛋白,encodingcoreprotein,reversetranscriptaseandenvelopeglycoprotein,respectively.9/17/202396

9/17/2023973）5‘端LTR下游有病毒包裝所必需的序列、引物結(jié)合位點(diǎn)等。Thereareasequencerequiredforefficientpackagingofvirusandaregionofprimerbindingsiteatthedownstreamof5’LTR.9/17/202398retrovirusvector9/17/202399

用于基因治療的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)由兩部分組成：Retroviralvectorsystemthatcanbeusedforgenetherapyisconstitutedbytwoparts.

將前病毒DNA中編碼蛋白的基因切除，Cutoffthegenegenesencodingviralproteins,

保留順式元件、包裝信號,andkeepcis-actingelementsandpackagingsignals

插入質(zhì)粒toinsertaplasmid----逆轉(zhuǎn)錄病毒載體formingaretroviralvector.9/17/2023100包裝細(xì)胞（packagingcell）是將缺失了包裝信號及相關(guān)序列的缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒（輔助病毒）導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞而制備成的特殊細(xì)胞。Packagingcellsareakindofspecialcelllinesthatcanenabledefectiveretrovirus(helpervirus)thatlackpackagingsignalsandcorrelationsequencetotransferintomammalcells.9/17/2023101將上兩部分結(jié)合使用即可產(chǎn)生攜帶治療基因，而只有一次感染能力的病毒顆粒------假病毒顆粒（pseudoviralparticles）Combineabovetwoparttoformpseudoviralparticlesthatcarrytherapygeneandcaninfect(ortransduce)targetcellsonlyonce.9/17/2023102假病毒感染效率非常高Highefficiencyoftransfection.

用于體內(nèi)基因治療時(shí)，只能感染增殖期細(xì)胞，有一定局限性。Thelimitedabilityofonlyinfectingdividingcellswhenusedingenetherapy.9/17/2023103逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(retrovirusvectors)腺病毒載體（adenovirus,Advectors）腺相關(guān)病毒（adenoassociatedvirus，AAvvectors）載體單純皰疹病毒（herpessimpexvirusvectors）載體TypesOfViruses9/17/2023104NakedDNATargetCellTherapeuticProteinAAVRetrovirus/LentivirusAdenovirusNucleusGeneTherapyPrinciples9/17/20231059/17/20231069/17/2023107二、基因轉(zhuǎn)移非生物學(xué)方法脂質(zhì)體（liposome）介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移利用陽離子脂質(zhì)單體與DNA混合，可自動形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，再通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用（endocytosis）將外源DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。

Liposome,positivelychargedlipiddroplets,caninteractwithnegativelychargedforeignDNAtowrapitupanddelivertocellsviaendocytosis.

9/17/20231082.細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移Genetransferviacellsurfacereceptors

受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用是轉(zhuǎn)移特異性外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的一種方式。Receptor-mediatedendocytosis

isoneofmannersoftransferringforeignmatterintocells.9/17/2023109細(xì)胞膜上存在一些專一性受體，與相應(yīng)的配體結(jié)合后，通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用，實(shí)現(xiàn)配體向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移。Thespecificreceptorsofcellmembranecancombinewithcorrespondingligands,andtransfertheligandsintocellsviaendocytosis.9/17/20231109/17/2023111將外源DNA與已證明有細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使DNA具有靶向性。Thetarget-specificactionofgenedeliverycanbeincreasedbycouplingligandswithhighcellortissueaffinity

withforeignDNA..9/17/2023112偶聯(lián)通常用多聚陽離子(condensedcation)，如多聚賴氨酸(polylysine)來實(shí)現(xiàn)。Couplingcanberealizedbycondensedcation,suchaspolylysine9/17/2023113如：僅在肝細(xì)胞表面的去唾液酸糖蛋白（ASGP）受體，它的天然配體是ASGP。帶有這種配體的DNA復(fù)和物可被定向送入肝細(xì)胞。Asialoglycoproteinreceptor(ASGP—R)isonlyexpressonthesurfaceofhepatocytes,anditsnaturalligandisasialoglycoprotein.DNAcomplexcarryingtheligandcanbetransferreddirectionallyintohepatocytes.9/17/20231143.直接注射進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移(DNAinjection)–直接將裸DNA注入動物或器官組織內(nèi)。‘Nude’DNAisdirectlyinjectedintoanimalsor

tissues.

9/17/2023115外源基因在肌肉中的表達(dá)量與注入的DNA含量成正比；TheamountofforeigngeneexpressionsinmuscleisindirectratiotothatofDNAdeliveredbyintramuscularinjection.

重復(fù)注射比一次注射效果好。

Theeffectofrepeatedinjectionismoreeffectivethanthatofsingleinjection.9/17/20231169/17/2023117優(yōu)點(diǎn)：Advantages制備簡單easytohandle排除病毒致癌的潛在危險(xiǎn)withoutcarcinogenic

riskofvirus9/17/2023118不需整合即可表達(dá)expressionwithoutneedingintegration可反復(fù)使用andcanbeadministeredagainandagain.9/17/2023119三、基因轉(zhuǎn)移的靶細(xì)胞

Targetcellsusedingenetransfer目前條件下，基因治療僅限于體細(xì)胞（嚴(yán)禁進(jìn)行生殖細(xì)胞的基因治療操作）Allcurrenthumangenetherapyapproachesaretargetedtosomaticcellsnotgerm-linecells.9/17/20231209/17/2023121

Somaticgenetherapy

9/17/2023122

選擇轉(zhuǎn)移基因的靶細(xì)胞，要考慮幾點(diǎn)：Howtoselecttargetcellsforgenetransfer?1）最好是組織特異性細(xì)胞Tissuespecificcellsarebetter.2）細(xì)胞較易獲得，Itiseasytoobtain.

3)生命周期較長Lifecycleislong.

9/17/20231234）易受外源物質(zhì)轉(zhuǎn)化Itiseasytobetransformbyforeignfactors5）轉(zhuǎn)染后細(xì)胞仍易成活I(lǐng)tiseasytosurviveaftertransfection.

9/17/2023124目前已開展的研究的靶細(xì)胞有：Targetcellsinpresentstudies

造血干細(xì)胞(hematopoieticstemcells)、淋巴細(xì)胞(lymphocytes)、皮膚成纖維細(xì)胞(skinfibroblasts)、肝細(xì)胞(hepatocytes)、血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascularendothelialcells,)、肌細(xì)胞(muscularcells,)、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(neurons&glialcells)、腫瘤細(xì)胞(tumourcells)等andsoon.9/17/2023125exvivoretroviralvectors(oncoretroviralorlentiviral)invivoadenoviralvectorsAAVvectorslentiviralvectors9/17/2023126第三節(jié)基因治療的應(yīng)用

applicationsofgenetherapy1990年基因治療的第一個(gè)病例是先天性腺苷脫氨酶(ADA)缺乏癥Thefirstdiseaseapprovedfortreatmentwithgenetherapywasadenosinedeaminase(ADA)deficiencyin1990.

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美國醫(yī)學(xué)家W·F·安德森等人對腺甘脫氨酶缺乏癥（ADA缺乏癥）的基因治療，是世界上第一個(gè)基因治療成功的范例。

1990年9月14日，安德森對一例患ADA缺乏癥的4歲女孩謝德爾進(jìn)行基因治療。這個(gè)4歲女孩由于遺傳基因有缺陷，自身不能生產(chǎn)ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在無菌的隔離帳里。他們將含有這個(gè)女孩自己的白血球的溶液輸入她左臂的一條靜脈血管中，這種白血球都已經(jīng)過改造，有缺陷的基因已經(jīng)被健康的基因所替代。在以后的10個(gè)月內(nèi)她又接受了7次這樣的治療，同時(shí)也接受酶治療。經(jīng)治療后，免疫功能日趨健全，能夠走出隔離帳，過上了正常人的生活。

謝德爾，19999/17/2023128一、對遺傳病進(jìn)行基因治療Genetherapyofhumangeneticdisease

研究范圍十分有限，須符合以下條件：Therangeofresearchisverylimited,whichmustmatchthefollowingconditions.1）在DNA水平上明確發(fā)病原因及機(jī)制Todefinethecausesandmechanisms

ofdiseasesattheDNAlevel.9/17/20231292）必須是單基因遺傳病Itmustbeamonogeneticorsingle－genedisease.9/17/20231303）表達(dá)不需要精確調(diào)控Accurateregulationofgeneexpression

isnotessential.

4）該遺傳病不經(jīng)治療有嚴(yán)重的后果Severeresultsmaybegotwithouttreatment.9/17/2023131二、對惡性腫瘤的基因治療CancerGeneTherapy較少涉及倫理問題，Lessethicsproblems臨床迫切需要，Itisneededurgentlyintheclinic.腫瘤的基因治療已走在前列。Thegenetreatmentoftumorshasalreadywalkedinadvance.9/17/2023132基因療法成為不少癌癥病人挽救生命的唯一選擇。Theonlychoiceistosavecancerpatients.9/17/2023133治療策略StrategiesofTherapy：導(dǎo)入抑癌基因以抑制癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移Transferoftumorsuppressorgenestoinhibittumorgrowthandmetastasis.

9/17/2023134干擾癌基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，抑制癌基因活性Interferewithtranscriptionortranslationofoncogeneinordertoinhibitoncogeneactivity9/17/2023135對瘤組織進(jìn)行細(xì)胞因子修飾，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性Modifycytokinegeneexpressionintumortissuebytransferring

genesto

enhanceimmuneresponse.導(dǎo)入自殺基因，殺傷癌細(xì)胞Transferofsuicidegenestocausedeathofcancercells.9/17/2023136三、病毒病的基因治療GeneTherapyofvirusdisease

抗病毒基因治療十分引人注目。包括調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能和針對病毒本身兩個(gè)方面。Theanti-virusgenetherapyisveryarrestive.Regulationofimmunologicalfunctionanddirecttreatmentofvirusaretwowaysofanti-virusgenetherapy.9/17/2023137前者主要是將細(xì)胞因子（干擾素、白介素）的基因?qū)朊庖呒?xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體對病毒的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。

Transductionof

cytokinegeneseg.interferonandinterleukin

toinduceshumoralandcellularimmuneresponsesagainstvirus.9/17/2023138后者Thelatter：1）誘導(dǎo)對病毒RNA的降解inducedegradationofviralRNA2）抑制病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合inhibitvirustocontactwithhostcells

3）干擾病毒基因組的轉(zhuǎn)錄起始interferethetranscriptioninitiationofviralgenome.9/17/2023139抑制病毒復(fù)制和蛋白合成inhibitviralreplicationandprotein

synthesisRNA干擾(RNAinterference,RNAi)9/17/2023140.干擾RNA，RNAi哺乳動物中的研究1999年才開始被認(rèn)為是最有前途的核酸藥物《Science》雜志將這一新發(fā)現(xiàn)評為2002年度世界十大科學(xué)成就之首.9/17/2023141In1990,RNAsilencingwasfirstobservedinplants.Thisphenomenawascalled“cosuppression”or“PTGS”(posttranscriptionalgenesilencing).PlantCell,vanderKroletal.1990,2(4):291-299ThehistoryofsiRNA9/17/2023142a起始階段：由于RNA病毒感染、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄和外源導(dǎo)入基因表達(dá)等原因,生物體細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)雙鏈RNA(dsRNA),dsRNA在一種具有RNaseⅢ樣活性的dsRNA特異性核酸內(nèi)切酶(dsRNAspecificendonuclease,Dicer)作用下,被裂解成由正義和反義鏈組成的21～23nt的干擾性小RNA(smallinterferingRNA,或shortinterferingRNAs,siRNA).9/17/2023143b效應(yīng)階段：目前認(rèn)為該階段存在兩種假說模式,一種假說模式是認(rèn)為siRNA作為向?qū)蛄?與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNAinducedsilencingcomplex,RISC)的無活性前體結(jié)合,在ATP參與下siRNA雙鏈結(jié)構(gòu)解旋誘導(dǎo)形成有活性的RISC,活性RISC隨即與同源性靶向mRNA結(jié)合,在與siRNA反義鏈配對區(qū)域的中部切斷同源性靶向mRNA,使其降解,從而干擾基因表達(dá),這稱為內(nèi)源性核苷酸裂解(endonucleolyticcleavage)9/17/2023144另一種假說模式為隨機(jī)降解性多聚酶鏈反應(yīng)(randomdegradativePCR),即siRNA作為針對靶向mRNA特殊引物,在RNA依賴性RNA多聚酶(RNAdependentRNApolymerase,RdRP)的作用下以靶向mRNA為模板合成靶向mRNA的互補(bǔ)鏈,使單鏈mRNA成為dsRNA,然后在Dicer酶的作用下被降解形成新的siRNA,新的siRNA又進(jìn)入上述過程,反復(fù)循環(huán)，從而形成信號擴(kuò)增系統(tǒng).9/17/2023145MechanismofShortinterferingRNAs—post-transcriptionalgenesilencing.9/17/2023146四、其他疾病的基因治療Genetherapyofotherdisorders人神經(jīng)退化疾病humanneurodegenerativediseases

（如帕金森氏病Parkinson'sdisease)9/17/2023147Morethan1.5millionAmericanssufferfromParkinson'sdisease.Thereisnocure.Butnowthereisanewtreatmentthatmayimprovepatients'