基因表達和檢測-PPT

基因表達和檢測蛋白A是一個胞漿蛋白，刺激之后會轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，怎么能實時觀察它的入核呢？在組織里檢測到蛋白A和蛋白B有相互作用，怎么能知道它們是否有直接的相互作用，以及決定它們相互作用的序列是哪一段？Questions一些基本的概念基因(gene)是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，是DNA或RNA分子上具有遺傳信息的特定核苷酸序列?；虮磉_(geneexpression)是指細(xì)胞在生命過程中，把儲存在DNA順序中遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子。生物體內(nèi)的各種功能蛋白質(zhì)和酶都是相應(yīng)的結(jié)構(gòu)基因編碼的?？寺?clone)，來源于希臘語Klon(嫩枝)。在園藝學(xué)上，克隆是指通過營養(yǎng)生殖產(chǎn)生的單一植株的后代，很多植物都是通過克隆這樣的無性生殖方式從單一植株獲得大量的子代個體。在廣義上是指利用生物技術(shù)由無性生殖產(chǎn)生與原個體有完全相同基因組后代的過程。在生物學(xué)上，是指選擇性地復(fù)制出一段DNA序列（分子克?。⒓?xì)胞（細(xì)胞克?。┗蚴莻€體（個體克隆）。基因克?。╣eneclone）基因克隆是指在體外對DNA按照即定目的和方案進行人工重組,將重組DNA進行擴增以獲得目的基因的大量拷貝?？寺』虮磉_的目的探索和研究基因的功能以及基因表達調(diào)控的機理克隆基因表達出所編碼的蛋白質(zhì)可供作結(jié)構(gòu)和功能的研究某些特定生物活性的蛋白質(zhì)可以在宿主細(xì)胞中大量表達而獲得，因此在醫(yī)學(xué)上甚至工業(yè)都有很重要的應(yīng)用價值。（胰島素制備，生長激素等）基因克隆技術(shù)Paul.Berg1980NobelPrice1972年把一種猿猴病毒的DNA與λ噬菌體DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來，于是產(chǎn)生了一種新的重組DNA分子，從此產(chǎn)生了基因克隆技術(shù)。WalterGilbert1980NobelPriceFrederickSanger1980NobelPrice1975年時，共同發(fā)展出一種稱為鏈終止法（chainterminationmethod）的技術(shù)來測定DNA序列，主要是先進行PCR，利用DNA引物和DNA聚合酶使DNA鏈得以展開復(fù)制，再利用雙去氧核苷酸（dideoxynucleotides）來終止DNA鏈的合成StanelyCohen1986NobelPrice1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段與質(zhì)粒DNA連接起來，構(gòu)成了一個重組質(zhì)粒，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，第一次完整地建立起了基因克隆體系。細(xì)菌質(zhì)粒（plasmid）HerbertW.Boyer發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的基因可與真核生物基因結(jié)合。用轉(zhuǎn)基因細(xì)菌人工合成了胰島素，隨后在1979年合成了生長激素。1976年與羅伯特·斯旺森建立了基因泰克公司。1980年獲拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究獎，1990年獲國家科學(xué)獎?wù)拢?004年獲邵逸夫獎。是一種細(xì)胞質(zhì)遺傳因子，是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)獨立于染色體外的一種復(fù)制子，它在細(xì)胞分裂時，能恒定地傳給子代細(xì)胞，并能給細(xì)胞帶來表觀效應(yīng)，但是它的消失并不影響細(xì)胞生存大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點染色體與質(zhì)粒存在于染色體外（細(xì)菌的DNA除大部分集中于核質(zhì)內(nèi)）雙鏈環(huán)形DNA分子量遠(yuǎn)比染色體為小，僅為細(xì)菌染色體DNA的0.5～3%質(zhì)粒亦可攜帶遺傳信息，可決定細(xì)菌的一些生物學(xué)特性質(zhì)粒并非細(xì)菌生存所必不可少的遺傳物質(zhì)質(zhì)粒的傳遞（轉(zhuǎn)移）是細(xì)菌遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移的一個重要方式。有些質(zhì)粒本身即具有轉(zhuǎn)移裝置，如耐藥性質(zhì)粒（R質(zhì)粒）；質(zhì)?？勺孕惺セ蚪?jīng)人工處理而消失。質(zhì)?？梢元毩?fù)制可有幾種質(zhì)粒同時共存在于一個細(xì)菌內(nèi)1.質(zhì)粒并非細(xì)菌生存所必不可少的遺傳物質(zhì)。細(xì)菌如失去染色體，則不能生存；然而細(xì)菌失去質(zhì)粒后仍能生存。這是由于染色體DNA攜帶的基因所編碼的產(chǎn)物，在細(xì)菌新陳代謝中是生存所必須者；而質(zhì)粒攜帶的基因所編碼的產(chǎn)物并非細(xì)菌的生存所必須者。因此質(zhì)?？梢栽诩?xì)菌間傳遞與丟失。2.質(zhì)粒的傳遞（轉(zhuǎn)移）是細(xì)菌遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移的一個重要方式。有些質(zhì)粒本身即具有轉(zhuǎn)移裝置，如耐藥性質(zhì)粒（R質(zhì)粒）；而有些質(zhì)粒本身無轉(zhuǎn)移裝置，需要通過媒介（如噬菌體）轉(zhuǎn)移或隨有轉(zhuǎn)移裝置的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)移。獲得質(zhì)粒的細(xì)菌可隨之而獲得一些生物學(xué)特性，如耐藥性或產(chǎn)生細(xì)菌素的能力等。3.質(zhì)粒可自行失去或經(jīng)人工處理而消失。在細(xì)菌培養(yǎng)傳代過程中，有些質(zhì)?？勺孕袕乃拗骷?xì)菌中失去。這種丟失不像染色體突變發(fā)生率很低，而是較易發(fā)生。用紫外線、吖啶類染料及其他可以作用于DNA的物理、化學(xué)因子處理后，可以使一部分質(zhì)粒消失，稱為消除。目前學(xué)者們感興趣的是如何通過人工處理消除耐藥質(zhì)?；蚺c致病性有關(guān)的質(zhì)粒。4.質(zhì)?？梢元毩?fù)制。質(zhì)粒為DNA，有復(fù)制的能力，質(zhì)粒的復(fù)制可不依賴于染色體，而在細(xì)菌胞漿內(nèi)進行。這一特性在基因工程中需擴增質(zhì)粒時很有用處，因可使細(xì)菌停止繁殖而質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制，從而可獲得大量的質(zhì)粒。5.可有幾種質(zhì)粒同時共存在于一個細(xì)菌內(nèi)。因質(zhì)粒可獨立復(fù)制，又能轉(zhuǎn)移入細(xì)菌和自然失去，因此就有機會出現(xiàn)幾種質(zhì)粒的共存。但是并非任何質(zhì)粒均可共存，因發(fā)現(xiàn)在有些情況下，兩種以上的質(zhì)粒能穩(wěn)定地共存于一個菌體內(nèi)，而有些質(zhì)粒則不能共存。質(zhì)?；蚩寺』蚩寺∈?0年代發(fā)展起來的一項具有革命性的研究技術(shù)，可概括為∶分、切、連、轉(zhuǎn)、選。"分"是指分離制備合格的待操作的DNA，包括作為運載體的DNA和欲克隆的目的DNA；"切"是指用序列特異的限制性內(nèi)切酶切開載體DNA，或者切出目的基因；"連"是指用DNA連接酶將目的DNA同載體DNA連接起來，形成重組的DNA分子；"轉(zhuǎn)"是指通過特殊的方法將重組的DNA分子送入宿主細(xì)胞中進行復(fù)制和擴增；"選"則是從宿主群體中挑選出攜帶有重組DNA分子的個體?；蚬こ碳夹g(shù)的兩個最基本的特點是分子水平上的操作和細(xì)胞水平上的表達，而分子水平上的操作即是體外重組的過程，實際上是利用工具酶對DNA分子進行"外科手術(shù)"。播放視頻分切、連轉(zhuǎn)選1.如何尋找合適的載體/質(zhì)粒？1）質(zhì)粒的分類2）質(zhì)粒各個元件的識別2.如何擴增得到DNA片段1）PCR技術(shù)2）引物設(shè)計3.如何將目的基因與載體連接？1）內(nèi)切酶，連接酶2）連接反應(yīng)4.如何將載體導(dǎo)入細(xì)胞或質(zhì)粒？5.基因產(chǎn)物的檢測基因克隆如何尋找合適的載體/質(zhì)粒？1）質(zhì)粒的命名2）質(zhì)粒各個元件的識別3）質(zhì)粒的分類1）質(zhì)粒命名質(zhì)粒載體的命名，首字母用小寫p表示，后面是一些描述性的縮寫，如:pBR322的字母代表研究者F.Bolivar和R.Rodriguez,而322是與研究者設(shè)計相關(guān)的數(shù)字編碼。如何尋找合適的載體/質(zhì)粒？1）質(zhì)粒的命名2）質(zhì)粒各個元件的識別****3）質(zhì)粒的分類2)質(zhì)粒的各個元件一個復(fù)制子（replicon）（DNA復(fù)制是從一個DNA復(fù)制起點開始，最終由這個起點起始的復(fù)制叉完成的片段。）幾個克隆位點一個選擇性標(biāo)記復(fù)制子多克隆酶切位點(MCSmultiplecloningsite)選擇性：選擇標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因選擇標(biāo)記基因抗生素抗性基因是目前使用最廣泛的選擇標(biāo)記。1．氨芐青霉素抗性基因（Ampicillinresistancegene,ampr）2．四環(huán)素抗性基因（Tetracyclineresistancegene,tetr）3．氯霉素抗性基因（chloramphenicolresistancegene,Cmr,cat）4．卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycinresistancegene,kanr,neor）5．琥珀突變抑制基因supFampR篩選標(biāo)記基因篩選標(biāo)記主要用來區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒，當(dāng)一個外源DNA片段插入到一個質(zhì)粒載體上時，可通過該標(biāo)記來篩選插入了外源片段的質(zhì)粒，即重組質(zhì)粒。1．插入失活通過插入失活進行篩選的質(zhì)粒主要有pBR322，該質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）兩種抗性標(biāo)記。當(dāng)外源DNA片段插入tetr基因后，導(dǎo)致tetr基因失活，變成只對氨芐青霉素有抗性。這樣就可通過對抗生素是雙抗還是單抗來篩選是否有外源片段插入到載體中。2．α-互補（α-complementation）

選擇性：選擇標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因ampR篩選標(biāo)記基因篩選標(biāo)記主要用來區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒，當(dāng)一個外源DNA片段插入到一個質(zhì)粒載體上時，可通過該標(biāo)記來篩選插入了外源片段的質(zhì)粒，即重組質(zhì)粒。1．插入失活2．α-互補（α-complementation）α-互補(Alphacomplementation)：噬菌體載體的基因間隔區(qū)插入E.coli的一段調(diào)節(jié)基因及l(fā)acZ的N端146個氨基酸殘基編碼基因，其編碼產(chǎn)物為β—半乳糖苷酶的α片段。突變型lac-E.coli可表達該酶的W片段（酶的C端）。單獨存在的α及W片段均無β半乳糖苷酶活性，只有宿主細(xì)胞與克隆載體同時共表達兩片段時，宿主細(xì)胞內(nèi)才有β半乳糖苷酶活性，使特異性作用物變?yōu)樗{(lán)色化合物，這就是所謂的α-互補。選擇性：選擇標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因選擇性：藍(lán)白斑篩選lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實現(xiàn)了互補，稱為α-互補。由α-互補而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識別。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。如何尋找合適的載體/質(zhì)粒？1）質(zhì)粒的命名2）質(zhì)粒各個元件的識別3）質(zhì)粒的分類克隆載體表達載體轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞克隆載體

（pBR322,pUC19）

克隆載體主要用于擴增或保存DNA片段，是最簡單的載體。大多是高拷貝的載體，一般是原核細(xì)菌，將需要克隆的基因與克隆載體的質(zhì)粒相連接，再導(dǎo)入原核細(xì)菌內(nèi)，質(zhì)粒會在原核細(xì)菌內(nèi)大量復(fù)制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定會表達，但一定被大量復(fù)制?？寺≥d體目的在于復(fù)制足夠多的目標(biāo)質(zhì)粒，所以常帶有較強的自我復(fù)制元件，如復(fù)制起始位點等，往往在菌體內(nèi)存在多拷貝，所以抽質(zhì)粒會抽出一大堆。但不具備表達元件。①能在宿主細(xì)胞中復(fù)制繁殖，而且最好要有較高的自主復(fù)制能力。②容易進入宿主細(xì)胞，而且進入效率越高越好。③容易插入外來核酸片段，插入后不影響其進入宿主細(xì)胞和在細(xì)胞中的復(fù)制。這就要求載體DNA上要有合適的限制性核酸內(nèi)切酶位點。④容易從宿主細(xì)胞中分離純化出來，這才便于重組操作。⑤有容易被識別篩選的標(biāo)志，當(dāng)其進入宿主細(xì)胞、或攜帶著外來的核酸序列進入宿主細(xì)胞都能容易被辨認(rèn)和分離出來。這才用于克隆操作表達載體

就是在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達元件（如啟動子、SD序列、終止子等），是目的基因能夠表達的載體。是否含有表達系統(tǒng)元件，即啟動子--核糖體結(jié)合位點--克隆位點--轉(zhuǎn)錄終止信號，這是用來區(qū)別克隆載體和表達載體的標(biāo)志。

根據(jù)受體細(xì)胞的不同可分為：1．原核表達系統(tǒng)將外源基因引入原核細(xì)胞，并使其在原核細(xì)胞中快速高效地表達、合成基因產(chǎn)物的體系。2．真核表達系統(tǒng)使外源基因在真核細(xì)胞中表達的體系。

原核表達系統(tǒng)的重要調(diào)控元件：啟動子SD序列終止子

原核表達系統(tǒng)的重要調(diào)控元件：啟動子(promoter,P)啟動子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表達不可缺少的重要調(diào)控序列，沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄一般長40-60bp，富含A-T堿基對具有保守序列：-10區(qū)（pribnowbox）：TATAAT-35區(qū)SD序列終止子

原核表達系統(tǒng)的重要調(diào)控元件：啟動子SD序列（Shine-Dalgarno）AUG上游3-11bp長約3-9bpmRNA與16s核糖體亞基間的識別與結(jié)合序列

終止子

SD序列與AUG之間的的距離,是影響mRNA轉(zhuǎn)譯成蛋白的重要因素之一原核表達系統(tǒng)的重要調(diào)控元件：啟動子SD序列終止子

（terminator，T）:位于基因3’端,給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列轉(zhuǎn)錄終止過程包括:1)RNA聚合酶停在DNA模板上不再前進2)完成轉(zhuǎn)錄的RNA從RNA聚合酶上釋放出來3)RNA聚合酶從模板上釋放出來表達載體根據(jù)受體細(xì)胞的不同可分為：1．原核表達系統(tǒng)將外源基因引入原核細(xì)胞，并使其在原核細(xì)胞中快速高效地表達、合成基因產(chǎn)物的體系。2．真核表達系統(tǒng)使外源基因在真核細(xì)胞中表達的體系。主要由CMVp啟動子、兔β-球蛋白基因內(nèi)含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架構(gòu)成，在大多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi)都能高水平穩(wěn)定地表達外源目的基因。更重要的是，由于該真核細(xì)胞表達載體中抗neo基因存在，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，用G418篩選，可建立穩(wěn)定的、高表達目的基因的細(xì)胞株。pEGFP表達載體中含有綠色熒光蛋白，在PCMV啟動子驅(qū)動下，在真核細(xì)胞中高水平表達。載體骨架中的SV40origin使該載體在任何表達SV40T抗原的真核細(xì)胞內(nèi)進行復(fù)制。Neo抗性盒由SV40早期啟動子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信號組成，能應(yīng)用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞株。此外，載體中的pUCorigin能保證該載體在大腸桿菌中的復(fù)制，而位于此表達盒上游的細(xì)菌啟動子能驅(qū)動kanamycin抗性基因在大腸桿菌中的表達。外源基因在原核細(xì)胞中的表達原核生物基因表達的特點:原核細(xì)胞缺乏真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng),同時原核細(xì)胞也缺乏真核細(xì)胞翻譯后的加工系統(tǒng)1.原核生物只有1種RNA聚合酶2.原核生物的基因表達是以操縱子為單位的3.原核生物無核膜,轉(zhuǎn)錄和翻譯是耦聯(lián)的4.原核基因不含有內(nèi)含子5.原核生物基因表達的控制主要是在轉(zhuǎn)錄水平，對RNA合成的調(diào)控有兩種方式:起始控制和終止控制6.在大腸桿菌mRNA的核糖體結(jié)合位點上，含有SD序列真核表達系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)具翻譯后修飾系統(tǒng)可實現(xiàn)真正的分泌表達基因治療外源基因在真核系統(tǒng)中的表達From《MolecularCellBiology》4thed

1.如何尋找合適的載體/質(zhì)粒？1）質(zhì)粒的分類2）質(zhì)粒各個元件的識別2.如何擴增得到DNA片段1）PCR技術(shù)2）引物設(shè)計2.如何擴增得到DNA片段

1）PCR技術(shù)2）引物設(shè)計PCR可以被認(rèn)為是與發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過相似的技術(shù)，其結(jié)果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)新的互補DNA片段。PCR由變性--退火--延伸三個本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。KaryMullis1992NobelPricePCR聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）PCR克隆方法的主要優(yōu)缺點優(yōu)點：1）快速簡單

2）高度敏感

3）樣本適應(yīng)范圍大缺點：1）必須預(yù)先知道DNA序列信息

2）擴增片段大小有限

3）保真度(PCR聚合酶)PCR實驗注意事項所有緩沖液、吸頭和離心管使用前必須經(jīng)過高壓處理。開始工作應(yīng)戴上手套，并應(yīng)勤于更換。準(zhǔn)備專用的成套試劑，分裝成小份。這些試劑不得用于其他用途。裝有PCR試劑的微量離心管打開之前，應(yīng)先在專用工作臺內(nèi)的微量離心機上作瞬時離心（10秒）。這樣可使液體沉積于管底，從而減少污染手套或加樣器的機會是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U增反應(yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細(xì)胞/組織中基因表達水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等PCR相關(guān)技術(shù)RT-PCR，逆轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）RT-PCR，逆轉(zhuǎn)錄PCR受多個因素影響，如硫酸鎂的濃度,引物退火的溫度，擴增的循環(huán)數(shù)等。

建議選擇0.5-3.0mM(相差0.5mM)的硫酸鎂作初步實驗。

對于具有較高Tm的引物，增加退火和延伸時的溫度對反應(yīng)有利。較高的溫度有利于減少非特異的引物結(jié)合，因而提高特異產(chǎn)物的得率。

大多數(shù)目標(biāo)RNA經(jīng)40輪PCR反應(yīng)就能觀察到。但如果目標(biāo)RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加擴增的次數(shù)到45-50次優(yōu)點：對目標(biāo)序列的高特異性陰性結(jié)果確定設(shè)計相對簡單與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補重復(fù)性比較好

缺點：只適合一個特定的目標(biāo);委托公司標(biāo)記，價格較高;不易找到本底低的探針RT-PCR，逆轉(zhuǎn)錄PCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴增反應(yīng)實時檢測。

實時定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進行定量分析PCR相關(guān)技術(shù)RT-PCR，實時熒光定量(real-timePCR)2.如何擴增得到DNA片段

1）PCR技術(shù)2）引物設(shè)計引物設(shè)計基本原則引物長度（primerlength）產(chǎn)物長度（productlength）序列Tm值(meltingtemperature)G+C含量（composition）引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplexformationandhairpin）錯誤引發(fā)位點（falseprimingsite）閱讀框1.引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，即Taq酶的最適溫度2.產(chǎn)物的長度擴增片段長度為100~600堿基對.3.Tm值引物的Tm值一般控制在55-60度,盡可能保證上下游引物的Tm值一致,一般不超過2度.如果引物中的G+C含量相對偏低,則可以使引物長度稍長,而保證一定的退火溫度.1退火溫度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5～8)4.引物的GC含量

有效引物中(G+C)的比例為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。5.引物自身引物3’端的堿基一般不用A，因為A在錯誤引發(fā)位點的引發(fā)效率相對比較高引物間3’端的互補、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗SPBamHIpcDNA3.1NR1-1a任務(wù)用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記蛋白NR1Plasmid1:SPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aGFP

121ggggctcctagagaacccgggggcgcttgaccgcgcgcgggcggcccgcgggtcgtacat181cgcgaggtcgtcgcactcgcgcaacccagagccaggcccgctgtgcccggagctcatgag241caccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcccgcgcGgATCC301cgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgtt361ccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgc421cacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct481catctctagccaggtctacgctatcctagttagccacccgcctactcccaacgaccactt541cactcccacccctgtctcctacacagctggcttctacagaatccctgtcctgggactgac601tacccgaatgtccatctactctgacaagagtatccacctgagtttccttcgcacggtgcc661gccctactcccaccagtccagcgtctggtttgagatgatgcgagtctacaactggaacca721catcatcctgctggtcagcgacgaccacgagggacgggcagcgcagaagcgcttggagac781gttgctggaggaacgggagtccaaggcagagaaggtgctgcagtttgacccaggaaccaa

NR1的編碼序列綠色為BamHI酶切位點,下劃線標(biāo)出酶切位點的閱讀框ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGFP序列引物要求PCR擴增GFPGFP兩邊添加BamHI酶切位點保證NR1的閱讀框不改變GFP序列：5’

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………GCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3‘TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGCGTACCTGCTCGACATGTTCATT55’

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………GCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3‘

CGTACCTGCTCGACATGTTCATT5'5'ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC3'TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5Primer1:5'GGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCPrimer2:5'ggatccttacttgtacagctcgtccatgcPrimer1:5'GGATCCgATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCPrimer2:5'ggatccGGttacttgtacagctcgtccatgc引物主體添加酶切位點注意閱讀框Primer1:5'ccgcGGATCCgATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCPrimer2:5'ccgcggatccGGttacttgtacagctcgtccatgc添加保護序列，注意GC比值From《MolecularCellBiology》4thed

分切、連1.如何尋找合適的載體/質(zhì)粒？1）質(zhì)粒的分類2）質(zhì)粒各個元件的識別2.如何擴增得到DNA片段1）PCR技術(shù)2）引物設(shè)計3.如何將目的基因與載體連接？內(nèi)切酶，連接酶，堿性磷酸酶3.如何將目的基因與載體連接？1）內(nèi)切酶2）堿基磷酸酶3）連接酶

（restrictionendonuclease）:一種在特殊核甘酸序列處水解雙鏈DNA的內(nèi)切酶。生物體內(nèi)能識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶。它是可以將外來的DNA切斷的酶，即能夠限制異源DNA的侵入并使之失去活力，但對自己的DNA卻無損害作用，這樣可以保護細(xì)胞原有的遺傳信息。由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進行的，故名限制性內(nèi)切酶(簡稱限制酶)。Ⅰ型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；Ⅱ型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。限制性內(nèi)切酶命名：

一般是以微生物屬名的第一個字母和種名的前兩個字母組成，第四個字母表示菌株（品系）。例如，從BacillusamyloliquefaciensH中提取的限制性內(nèi)切酶稱為BamH，在同一品系細(xì)菌中得到的識別不同堿基順序的幾種不同特異性的酶，可以編成不同的號，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。單位定義

在指明pH與37℃，在0.05mL反應(yīng)混合物中，1小時消化1μg的λDNA的酶量為1單位5’-G/AA*TTC-3’3’-CCTA*A/G-5’-酶切位點用“/”表示.-甲基化位點用*.Restriction-recognitionsitesareshortDNAsequencesrecognizedandcleavedbyvariousrestrictionendonucleases

1）測試酶切DNA的量

2）計算完全酶切所需的酶量。為使終體積中甘油的濃度低于8%，計算能加的酶量，最多能加終體積的10%（甘油的濃度為5%）。

3）10X反應(yīng)液的體積應(yīng)為終體積的1/10；10X反應(yīng)液的體積不應(yīng)小于酶的體積。

4）加入計算好的DNA，10X反應(yīng)液，酶。

5）加入水到終體積（20-50ul），輕輕混勻，在適當(dāng)?shù)臏囟认卤亍Ｒ话忝傅淖钸m溫度為37度，但有例外。應(yīng)查訊分析說明。

比如：

質(zhì)粒DNA（2ug/ul）5ul

10X反應(yīng)液5ul

酶（5ug/ul）5ul

dH2O

35ul

50ul

37度保溫2-3小時。

單酶切流程雙酶切流程

1.一次使用兩個限制性內(nèi)切酶的一般步驟，如同使用一個限制性內(nèi)切酶的一般步驟。2.注意兩個限制性內(nèi)切酶在同一種緩沖液中都要有活力。甘油的濃度不應(yīng)超過終體積的8%。3.選擇合適的緩沖液3.如何將目的基因與載體連接？1）內(nèi)切酶2）堿基磷酸酶（alkalinephosphatase）堿性磷酸酶是一種能夠?qū)?yīng)底物去磷酸化的酶，即通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團除去，并生成磷酸根離子和自由的羥基，這類底物包括核酸、蛋白、生物堿等。而該脫去磷酸基團的過程被稱為去磷酸化或脫磷酸化。3）連接酶AlkalinePhosphatase2Pi堿性磷酸酶LigaseNoReactionPOHPOHVectorDNAInsertDNAOHOHPPLigaseOHOHOHOHTransformation(bugsgrow)NickNick3.如何將目的基因與載體連接？1）內(nèi)切酶2）堿基磷酸酶（alkalinephosphatase）3）連接酶DNA連接酶是1967年在三個實驗室同時發(fā)現(xiàn)的。它是一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結(jié)合的(T4DNA連接酶除外)，而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵

平末端連接-效率低-仍然可以使用T4噬菌體連接酶.-需要高濃度的DNA-一般只能連接3-4kd.From《MolecularCellBiology》4thed

分切、連轉(zhuǎn)1.如何尋找合適的載體/質(zhì)粒？1）質(zhì)粒的分類2）質(zhì)粒各個元件的識別2.如何擴增得到DNA片段1）PCR技術(shù)2）引物設(shè)計3.如何將目的基因與載體連接？1）內(nèi)切酶，連接酶2）連接反應(yīng)4.如何將載體導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)菌？4.如何將載體導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)菌導(dǎo)入細(xì)菌1）感受態(tài)細(xì)菌2）CaCl2轉(zhuǎn)化法3）電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入哺乳細(xì)胞磷酸鈣轉(zhuǎn)染法脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染電穿孔轉(zhuǎn)染法以病毒為載體指經(jīng)過適當(dāng)處理后容易接受外來DNA進入的細(xì)胞。如大腸桿菌經(jīng)CaCl2處理，成為容易受質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。

一般來說,感受態(tài)細(xì)胞的最基本要求是：1、沒有質(zhì)粒2、容易被轉(zhuǎn)進去（一般是G-細(xì)菌，細(xì)胞壁薄）3、營養(yǎng)條件一般，非苛養(yǎng)菌制備感受態(tài)細(xì)胞時,測OD600在0.3--0.5之間，空白用無菌體的LB培養(yǎng)基。1)感受態(tài)的感受效率最關(guān)鍵的是一個冷字，剛制備的感受態(tài)其感受效果最好，但是隨著時間的延長感受效果會逐漸下降，所以要將制好的感受態(tài)細(xì)胞凍存于液氮中，或-70度冰箱保存，這樣感受效果才不至下降過快。2)一般感受態(tài)制備好以后２４小時其轉(zhuǎn)化效率最高，隨后就逐漸下降。3)一般的宿主菌都不要傳代太多，傳多了就容易狀態(tài)不好和污染雜菌。4)狀態(tài)好的時候建議凍上一批，用EP管分裝好，然后，每次就可以取凍存的菌種來擴增使用。1）感受態(tài)細(xì)菌2）氯化鈣轉(zhuǎn)化

1.氯化鈣（二價鈣離子）的作用：提高細(xì)胞壁（膜）的通透性；

2.熱激后迅速轉(zhuǎn)移到冰上：促使質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移進入胞內(nèi)；

3.這種轉(zhuǎn)化方法適用于雙鏈環(huán)狀DNA（質(zhì)粒），線型DNA不能采用此法。（在自然界自然發(fā)生的轉(zhuǎn)化過程中，進入細(xì)菌細(xì)胞中的為單鏈DNA。）4.如何將載體導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)菌導(dǎo)入細(xì)菌（感受態(tài)細(xì)菌）CaCl2轉(zhuǎn)化法電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入哺乳細(xì)胞（瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染）

瞬時轉(zhuǎn)染：在DNA導(dǎo)入后1-4天內(nèi)進行分析1）磷酸鈣轉(zhuǎn)染法2）脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染3）電穿孔轉(zhuǎn)染法4）病毒載體5）DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染這幾種方法除DEAE-葡聚糖法外，均可用于暫時性轉(zhuǎn)染和永久性轉(zhuǎn)染。但它們有各自適用的細(xì)胞系。培養(yǎng)的細(xì)胞不同，其在攝取和表達外源DNA的能力上可能存在幾個數(shù)量級的差異。因此針對細(xì)胞系優(yōu)化并比較幾種不同方法的效率很重要1）磷酸鈣轉(zhuǎn)染法

核酸以磷酸鈣-DNA共沉淀物的形式出現(xiàn)時，可使DNA附在細(xì)胞表面，利于細(xì)胞吞入攝取，或通過細(xì)胞膜脂相收縮時裂開的空隙進入細(xì)胞內(nèi)，進入細(xì)胞的DNA僅有1%～5%可以進入細(xì)胞核中，其中僅有不到1%的DNA可以與細(xì)胞DNA整合，在細(xì)胞中進行穩(wěn)定表達，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率大約為10-4，這項技術(shù)能用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類動物進行暫時性表達或長期轉(zhuǎn)化的研究。此方法對于貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染是最常用并首選的方法2)脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染法脂質(zhì)體(lipofectinregeant,LR)試劑是陽離子脂質(zhì)體N-[1-2，3-Dioleyoxy,Propyl]-n,n,n-TrimethylammoniumChloride(DOTMA)和Dioleoylphotidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前條件下最方便的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。因LR對細(xì)胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時間以不超過24小時為宜。細(xì)胞種類：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細(xì)胞均可作為受體細(xì)胞。3)活體電穿孔法(invivoelectroporation)

是將外源基因通過電場作用，導(dǎo)入動物目標(biāo)組織或器官。由于這種方法能有效導(dǎo)入外源基因，可在多種組織器官上應(yīng)用,并且效率較高?；铙w電穿孔法的原理很簡單,在直流電場作用的瞬間,細(xì)胞膜表面產(chǎn)生疏水或親水的微小通道105～115μm,這種通道能維持幾毫秒到幾秒,然后自行恢復(fù)。在此期間生物大分子如DNA可通過這種微小的通道進入細(xì)胞。胚胎電轉(zhuǎn)化新生鼠電轉(zhuǎn)化4）病毒載體轉(zhuǎn)染常用的病毒載體有腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染分裂期細(xì)胞，而且容量有限。腺病毒一般不能整合到染色體上，只能進行瞬時感染。慢病毒（LV）具有可以感染非分裂期細(xì)胞、容納外源性基因片段大，可以長期表達等顯著優(yōu)點。慢病毒不產(chǎn)生任何有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答，可作為一種體外基因運輸?shù)墓ぞ?。慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達能持續(xù)數(shù)月，且無可觀察到的病理學(xué)現(xiàn)象5)DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法

DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，其原理還不清楚，可能是通過內(nèi)吞噬作用而使DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)進入細(xì)胞核，此法只適合暫時轉(zhuǎn)染實驗，轉(zhuǎn)染效率與DEAE-葡聚糖濃度以及細(xì)胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時間的長短很有關(guān)系，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用較短時間(30分鐘-1.5小時)，又可用較低濃度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用較長時間(8小時)。轉(zhuǎn)染方法原理主要應(yīng)用特點DEAE帶正電的瞬時轉(zhuǎn)染相對簡便、重復(fù)比磷酸鈣好，但對細(xì)胞有一定的毒副作用，轉(zhuǎn)染時需除血清且一般只用于磷酸鈣法磷酸鈣穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，染瞬轉(zhuǎn)染不適用于原代細(xì)胞（所需的細(xì)胞建議用陽離子脂質(zhì)體法帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團形成復(fù)合物，然后脂質(zhì)體上剩余的電核與細(xì)胞膜上的唾液酸殘基的負(fù)電核結(jié)合；另一種解釋是通過細(xì)胞是內(nèi)吞作用而被進入細(xì)胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時轉(zhuǎn)染，所有細(xì)胞使用方法簡單，可攜帶大片段陽離子聚合物帶正電的聚合物與核酸帶負(fù)電的磷酸基團形成帶正電的復(fù)合物后與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用，并通過內(nèi)吞作用進入細(xì)胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時轉(zhuǎn)染，所有細(xì)胞除了具有陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率高，操作簡單，適用范圍廣，重復(fù)性好等特點外，還具有在體內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性低等特點，是新一代的轉(zhuǎn)染試劑。病毒介導(dǎo)法逆轉(zhuǎn)錄病毒通過病毒中膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用而進入宿主細(xì)胞，之后反轉(zhuǎn)入酶啟動合成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，特定宿主細(xì)胞可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等，但攜帶基因不能太大（

腺病毒先和細(xì)胞表面的受體結(jié)合，繼而在瞬時轉(zhuǎn)染，特定宿主細(xì)胞可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，需考慮安全因素Biolistic將瞬時性轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可用于：人的表皮細(xì)胞，纖維原細(xì)胞，淋巴細(xì)胞系以及原代細(xì)胞顯微注射法用顯微操作將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限，多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動物的胚胎細(xì)胞電穿孔法高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時轉(zhuǎn)染，所有細(xì)胞適用性廣，除了質(zhì)粒外，還可轉(zhuǎn)染大的基因組（外源基因進入細(xì)胞后，部分能夠通過細(xì)胞質(zhì)進入細(xì)胞核內(nèi)，根據(jù)細(xì)胞類型，至多80％的進入核內(nèi)的外源DNA得到瞬時表達。極少數(shù)情況下，進入細(xì)胞的外源DNA通過系列非同源性分子間重組核連接，形成巨大的結(jié)構(gòu)最終整合進細(xì)胞染色體。細(xì)胞基因組自由部分表達，所以整合并不一定意味著表達，只有整合到表達區(qū)