大二上學(xué)期生物化學(xué)4酶

第四章酶學(xué)Enzyme

學(xué)習(xí)綱要酶促反應(yīng)特點及酶的分類酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系酶的作用機(jī)制酶促反應(yīng)動力學(xué)酶的活力測定學(xué)習(xí)提要本章著重介紹酶的化學(xué)本質(zhì)、結(jié)構(gòu)、特性和功能、酶反應(yīng)動力學(xué)，對調(diào)節(jié)酶、同工酶、多酶體系、誘導(dǎo)酶和固相酶等術(shù)語的含義和重要性也作了必要的介紹。在學(xué)習(xí)本章時應(yīng)注意：1.首先認(rèn)識酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，同一般蛋白質(zhì)有共同之處，也有不同之處。從結(jié)構(gòu)上與一般蛋白質(zhì)的共同點去理解酶的理化性質(zhì)；從不同點去理解酶的特異性、催化作用和催化機(jī)理。2.結(jié)合酶的化學(xué)本質(zhì)和催化機(jī)制學(xué)習(xí)各種影響酶反應(yīng)速度的因素。酶學(xué)研究簡史(自學(xué))公元前兩千多年，我國已有釀酒記載。一百余年前，Pasteur認(rèn)為發(fā)酵是酵母菌細(xì)胞生命活動的結(jié)果。1879年,Kuhne首次提出Enzyme一詞。1897年，Buchner兄弟用不含細(xì)胞的酵母提取液，實現(xiàn)了發(fā)酵。(1911,諾貝爾獎)1926年，sumner首次從刀豆中提純出脲酶結(jié)晶證明酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)。（1949,諾貝爾獎）核酶(ribozyme)

1981～1982年，ThomasR.Cech實驗發(fā)現(xiàn)有催化活性的天然RNA—Ribozyme。（1989,諾貝爾獎）

L19RNA和核糖核酸酶P中的RNA組分具有酶活性。

50S亞基中的23SrRNA具有肽?；D(zhuǎn)移酶的活性．

1995年，發(fā)現(xiàn)DNA的催化活性。抗體酶（abzyme）：

1986年，RichardLerrur和PeterSchaltz運(yùn)用單克隆抗體技術(shù)制備了具有酶活性的抗體（catalyticantibody）。酶的概念：

目前將生物催化劑分為為兩類：

蛋白酶、核酶酶是一類由活細(xì)胞產(chǎn)生的，以蛋白質(zhì)為主要成分的生物催化劑。第一節(jié)酶促反應(yīng)特點及酶的分類（自學(xué)）一、酶促反應(yīng)的特點（一）酶與一般催化劑的共同點在反應(yīng)前前后沒有質(zhì)和量的變化；只能催人熱力學(xué)允許的化學(xué)反應(yīng)；只能加速可逆反應(yīng)的進(jìn)程，而不改變平衡點。（二）酶催化作用特性酶的催化作用可使反應(yīng)速度提高106-1013倍。例如：過氧化氫酶催化H2O2的分解1．高效性用

-淀粉酶催化淀粉水解，1克結(jié)晶酶在65C條件下可催化2噸淀粉水解。用Fe+

催化，效率為10-5

mol/mol.S，而用過氧化氫酶催化，效率為105mol/mol.S。2H2O22H2O+O2酶的專一性又稱為特異性，是指酶在催化生化反應(yīng)時對底物具有選擇性2．高度選擇性酶促反應(yīng)一般在pH5-8水溶液中進(jìn)行，反應(yīng)溫度范圍為20-40

C。高溫或其它苛刻的物理或化學(xué)條件，將引起酶的失活。3．反應(yīng)條件溫和（對外界環(huán)境高度敏感性）4.酶活力可調(diào)節(jié)控制（可調(diào)性）如抑制劑調(diào)節(jié)、共價修飾調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、酶原激活及激素控制等。

酶的催化特性歸納：三“高”一“調(diào)”（或四“性”）二、酶專一性的類別酶作用專一性反應(yīng)專一性立體異構(gòu)專一性相對專一性絕對專一性鍵專一性基團(tuán)專一性光學(xué)專一性幾何專一性定義：酶對所作用的底物具有的選擇性類型：相對專一性：可作用于一類或一些結(jié)構(gòu)很相似的底物。例如：RCOO-+ROH+H+′酯酶：R—C—O—R′+H2OOOCH2OHOHOHOH15α-葡萄糖苷酶OR+H2OOCH2OHOHOHOHOH15+ROH（鍵專一性）（基團(tuán)專一性）絕對專一性：酶只作用于特定結(jié)構(gòu)的底物，進(jìn)行一種專一的反應(yīng)，生成一種特定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物

。光學(xué)專一性（對有旋光性物質(zhì)）一種酶只能作用于幾何異構(gòu)體或生成幾何異構(gòu)體中的一種，例：延胡索酸酶，只能催化反—丁稀二酸水化生成蘋果酸當(dāng)S具有旋光異構(gòu)體時，酶只作用于其中的一種，例：氨基酸氧化酶，只作用于L—氨基酸幾何專一性（對順反異構(gòu)體）CH2COOHHO—CH—COOHHCCOOHHOOCCH+H2O三.酶的命名1.習(xí)慣命名法:

（1）根據(jù)其催化底物來命名；（2）根據(jù)所催化反應(yīng)的性質(zhì)來命名；（3）結(jié)合上述兩個原則來命名；（4）有時在這些命名基礎(chǔ)上加上酶的來源或其它特點。2.國際系統(tǒng)命名法系統(tǒng)名稱包括底物名稱、構(gòu)型、反應(yīng)性質(zhì),2個底物，底物之間“：”，水解酶水解2字可省略，最后加一個酶字。例如：習(xí)慣名稱:谷丙轉(zhuǎn)氨酶系統(tǒng)名稱:L-丙氨酸：

-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶酶催化的反應(yīng):

谷氨酸+丙酮酸

-酮戊二酸+丙氨酸一些酶的命名舉例四、酶的分類1961年國際酶學(xué)委員會（EnzymeCommittee,EC）根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類型和機(jī)理，把酶分成6大類：1.氧化還原酶類：主要是催化氫的轉(zhuǎn)移或電子傳遞的氧化還原反應(yīng)。AH2+B（O2）A+BH2（H2O2，H2O）（1）脫氫酶類：催化直接從底物上脫氫的反應(yīng)。AH2+BA+BH2（需輔酶Ⅰ或輔酶Ⅱ）丙酮酸乳酸乳酸脫氫酶（2）氧化酶類①催化底物脫氫，氧化生成H2O2：AH2+O2A+H2O2（需FAD或FMN）②催化底物脫氫，氧化生成H2O：2AH2+O22A+2H2O（3）過氧化物酶ROO+H2O2RO+H2O+O22.轉(zhuǎn)移酶類：催化化合物中某些基團(tuán)的轉(zhuǎn)移。A·X+BA+B·X根據(jù)X分成8個亞類：轉(zhuǎn)移碳基、酮基或醛基、?；⑻腔?、烴基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。3.水解酶類：催化加水分解作用。AB+H2OAOH+BH羧酸脂酶催化脂的水解反應(yīng)4、裂解酶類：催化非水解性地除去基團(tuán)或形成雙鍵反應(yīng)及其逆反應(yīng)。主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。CH3C=OCOOHC—C鍵CH3C=OH+CO2C—O鍵CH2COOHHO—CH—COOHHCCOOHHOOCCH+H2OC—N鍵COOHCH—NH2CH2COOHCOOHCHHCCOOH+NH35、異構(gòu)酶：催化各種異構(gòu)體之間的互變。常見的有消旋和變旋、醛酮異構(gòu)、順反異構(gòu)和變位酶類。

PP合成酶催化C-C、C-O、C-N以及C-S鍵等的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)通常與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)(需能反應(yīng))。

A+B+ATP+H-O-H===A

B+ADP+Pi主要包括連接酶(Ligase),合成酶,羧化酶等例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)丙酮酸+CO2

草酰乙酸6.合成酶SynthetaseCOOHC=OCH3CO2+COOHC=OCH2COOH乳酸脫氫酶

EC1.1.1.27第1大類，氧化還原酶第1亞類，氧化基團(tuán)CHOH第1亞亞類，H受體為NAD+該酶在亞亞類中的流水編號五、酶的系統(tǒng)編號第二節(jié)酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一.酶的化學(xué)本質(zhì)

大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)1926年J.B.Sumner首次從刀豆制備出脲酶結(jié)晶，證明其為蛋白質(zhì)，并提出酶的本質(zhì)就是蛋白質(zhì)的觀點。酶是蛋白質(zhì)的證據(jù)：從化學(xué)組成和理化性質(zhì)看。1982年T.Cech發(fā)現(xiàn)了第一個有催化活性的天然RNA——ribozyme（核酶），以后Altman和Pace等又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了真正的RNA催化劑。核酶的發(fā)現(xiàn)不僅表明酶不一定都是蛋白質(zhì)，還促進(jìn)了有關(guān)生命起源、生物進(jìn)化等問題的進(jìn)一步探討。輔基(prostheticgroup)酶單成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。雙成份酶酶蛋白輔因子（簡單蛋白質(zhì)）（結(jié)合蛋白質(zhì)）（apoenzyme）（cofacter)輔酶（coenzyme)全酶(holoenzyme）=酶蛋白+輔因子二.酶的組成1.單體酶（monomericenzyme)：僅有一條具有活性部位的多肽鏈，屬于單純酶，全部參與水解反應(yīng)。2.寡聚酶

(oligomericenzyme)：由幾個或多個亞基組成，如ATP酶有10個亞基。單個亞基沒有催化活性，亞基之間以非共價鍵結(jié)合。3.多酶復(fù)合物

(multienzymesystem)：幾個酶鑲嵌而成的復(fù)合物。這些酶催化將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的一系列順序反應(yīng)，可提高酶促反應(yīng)的速度。例丙酮酸脫氫酶系，它包括三種酶和六種輔因子，催化丙酮酸迅速地進(jìn)行連續(xù)幾步的氧化脫羧反應(yīng)。根據(jù)酶分子的性質(zhì)和大小分為三類：

一)、酶的輔助因子（輔因子）輔因子輔酶：與酶蛋白結(jié)合較松，用透析法可以除去的小分子有機(jī)物。輔基：與酶蛋白結(jié)合較緊，不能用透析法除去的小分子有機(jī)物。金屬離子：如Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co2+酶的催化專一性主要決定于酶蛋白部分;輔因子通常是作為電子、原子或某些化學(xué)基團(tuán)的載體，決定催化的性質(zhì)或反應(yīng)類型

輔因子的定義：酶分子中對熱穩(wěn)定的非蛋白質(zhì)部分。

輔因子的類型：包括金屬離子和小分子有機(jī)化合物，后者又依據(jù)與酶蛋白的結(jié)合程度不同分為：輔酶和輔基*各部分在催化反應(yīng)中的作用酶蛋白決定反應(yīng)的特異性輔助因子決定反應(yīng)的種類與性質(zhì)金屬酶(metalloenzyme)金屬離子與酶結(jié)合緊密，提取過程中不易丟失。

金屬激活酶(metal-activatedenzyme)金屬離子為酶的活性所必需，但與酶的結(jié)合不甚緊密。金屬離子是常見的輔助因子

金屬酶金屬離子金屬激活酶金屬離子過氧化氫酶Fe2+丙酮酸激酶K+，Mg2+過氧化物酶Fe2+丙酮酸羧化酶Mn2+，Zn2+谷胱苷肽過氧化物酶Se蛋白激酶Mg2+,Mn2+己糖激酶Mg2+精氨酸酶Mn2+固氮酶Mo2+磷脂酶CCa2+核糖核苷酸還原酶Mn2+細(xì)胞色素氧化酶Cu2+羧基肽酶Zn2+脲酶Ni2+碳酸酐酶Zn2+檸檬酸合酶K+金屬酶和金屬激活酶

酶的輔因子作用酶的輔因子是酶的對熱穩(wěn)定的非蛋白小分子物質(zhì)部分，其主要作用是作為電子、原子或某些基團(tuán)的載體參與反應(yīng)并促進(jìn)整個催化過程。(1)傳遞電子體：如卟啉鐵、鐵硫簇；(2)傳遞氫（遞氫體）：如FMN/FAD、NAD/NADP、C0Q、硫辛酸；(3)傳遞酰基體：如C0A、TPP、硫辛酸；(4)傳遞一碳基團(tuán)：如四氫葉酸；(5)傳遞磷酸基：如ATP，GTP；(6)其它作用：

轉(zhuǎn)氨基，如VB6；傳遞CO2，如生物素。小分子有機(jī)化合物在催化中的作用

二)、酶的活性中心必需基團(tuán)：酶分子中若經(jīng)化學(xué)修飾使其結(jié)構(gòu)改變，則酶的活性喪失的基團(tuán)；一些與酶活性密切相關(guān)的基團(tuán)。活性部位：酶分子中直接與底物結(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的部位。必需基團(tuán)活性部位活性部位以外的必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán)專一性催化性質(zhì)結(jié)構(gòu)基團(tuán)維持構(gòu)象所必需三)、酶的分子結(jié)構(gòu)與催化活性酶的活性中心：酶分子中能與底物特異的結(jié)合并催化底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的區(qū)域。（這個區(qū)域具有一定的空間構(gòu)型，且有關(guān)基團(tuán)靠得比較近，而它在一級結(jié)構(gòu)中卻離得比較遠(yuǎn)）溶菌酶的活性中心*谷氨酸35和天冬氨酸52是催化基團(tuán)；*色氨酸62和63、天冬氨酸101和色氨酸108是結(jié)合基團(tuán)；*A~F為底物多糖鏈的糖基，位于酶的活性中心形成的裂隙中。63氨基酸側(cè)鏈未折疊蛋白質(zhì)結(jié)合部位折疊蛋白質(zhì)氫鍵鹽鍵底物酰基水構(gòu)成酶活性中心的常見基團(tuán)：His的咪唑基、Ser的－OH、Cys的－SH、Glu的γ-COOH?；钚圆课唬ɑ钚灾行模┑奶攸c：1.活性部位僅占酶的整個體積的相當(dāng)小的一部分。2.

活性部位是個三維的實體。3.結(jié)合的專一性決定于活性部位中精確規(guī)定的原子的排列。4.大多數(shù)底物都以相當(dāng)弱的力結(jié)合在活性部位。5.

活性部位往往是裂隙、裂縫或“口袋狀”等,且可深入酶分子內(nèi)部，并多為ａａ殘基的疏水基團(tuán)組成的疏水環(huán)境。三.酶高級結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系（一）活性中心與活性直接相關(guān)胰蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)（活性中心）（二）聚合與解聚—四級結(jié)構(gòu)與酶的活性的關(guān)系1.聚合與解聚時均有活性如：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶，每個亞基都有一個活性中心。2.聚合時有活性，解聚時無活性3.解聚時有活性，聚合時無活性如：cAMP依賴性蛋白激酶（四聚體，兩個催化亞基，兩個調(diào)節(jié)亞基）如：乙酰CoA羧化酶四、酶原的激活酶原——沒有活性的、酶的前體。酶原的激活——酶原在一定條件下，轉(zhuǎn)變成有活性的酶的過程。酶原激活的機(jī)理：酶原一個或幾個特定的肽鍵斷裂，水解掉一個或幾個短肽在特定條件下分子構(gòu)象發(fā)生改變形成或暴露出酶的活動中心實質(zhì)是:酶活性部位形成或暴露的過程酶胰凝乳蛋白酶原的激活I(lǐng)le與Arg間切酪氨酸與蘇氨酸酶原激活的生理意義

避免細(xì)胞產(chǎn)生的酶對細(xì)胞進(jìn)行自身消化，并使酶在特定的部位和環(huán)境中發(fā)揮作用，保證體內(nèi)代謝正常進(jìn)行。

有的酶原可以視為酶的儲存形式。在需要時，酶原適時地轉(zhuǎn)變成有活性的酶，發(fā)揮其催化作用。如:凝血酶第三節(jié)酶的作用機(jī)制一、酶促反應(yīng)與活化能任何反應(yīng)都需要一定的能量，有了能量分子就能活化成活化分子

1、活化分子：能量達(dá)到或高于分子平均能量的分子（三好學(xué)生成績高于平均）。2、活化能（是個能障）：分子由基態(tài)到活化態(tài)所需的能量。

在一個反應(yīng)體系中，活化能越高，活化分子越少，反應(yīng)速度越慢；否則反之。（比喻跳高：跳過1.5米才得60分，很多達(dá)不到；如果要跳過1.0米獲60分的話，很多達(dá)到）促使化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的途徑：用加熱或光照給反應(yīng)體系提供能量。使用催化劑降低反應(yīng)活化能。酶和一般催化劑的作用就是：降低化學(xué)反應(yīng)所需的活化能，從而使活化分子數(shù)增多，反應(yīng)速度加快。酶促反應(yīng)的機(jī)制

———降低反應(yīng)的活化能活化能：底物分子從初態(tài)轉(zhuǎn)變到活化態(tài)所需的能量。據(jù)估計有酶催化可降低100萬倍.反應(yīng)總能量改變非催化反應(yīng)活化能酶促反應(yīng)活化能

一般催化劑催化反應(yīng)的活化能能量反應(yīng)過程底物產(chǎn)物二、中間產(chǎn)物學(xué)說E+SESE+P中間產(chǎn)物存在的證據(jù)：1.同位素32P標(biāo)記底物法

2.吸收光譜法要點：酶促反應(yīng)改變了原反應(yīng)的過程（歷程）S具有一定的活化能，當(dāng)S和E結(jié)合成過渡肽的中間物時，要釋放一部分結(jié)合能，這部分能量的釋放，使得過濾態(tài)的中間物處于比E+S更低的能級，因此使整個反應(yīng)的活化能降低，使反應(yīng)大大加速。S同E結(jié)合成中間復(fù)合物是一種非共價結(jié)合，依靠氫鍵、離子鍵、范德華力等次級鍵來維持。

酶分子為酶的催化提供各種功能基團(tuán)和形成特定的活性中心，酶與底物結(jié)合成中間產(chǎn)物，使分子間的催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿觾?nèi)的催化反應(yīng)。三、決定酶高效性的機(jī)制

（一）鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)鄰近：是底物向酶的活性中心靠近，從而形成局部區(qū)域高濃度（底物濃度從10—3M→102M，相當(dāng)于將底物濃度濃縮了10萬倍）定向：S有規(guī)律地排列在活性中心周圍（打飯時排隊而不是一窩蜂）反應(yīng)速度與底物濃度成正比，反應(yīng)速度這時最少可擴(kuò)大1000倍，最高可達(dá)100萬倍。鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)是加速反應(yīng)速度的主要原因（二）共價催化催化劑通過與底物形成反應(yīng)活性很高的共價過渡產(chǎn)物，使反應(yīng)活化能降低，從而提高反應(yīng)速度的過程，稱為共價催化。酶中參與共價催化的基團(tuán)主要包括His的咪唑基，Cys的巰基，Asp的羧基，Ser的羥基等。某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與共價催化作用。胰凝乳蛋白酶反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)制結(jié)合底物His57質(zhì)子供體形成共價ES復(fù)合物C-N鍵斷裂底物羰基產(chǎn)物釋放四面體中間物的瓦解水親核攻擊羧基產(chǎn)物釋放(三)酸堿催化：酸-堿催化可分為狹義的酸-堿催化和廣義的酸-堿催化。酶參與的酸-堿催化反應(yīng)一般都是廣義的酸－堿催化方式。廣義酸－堿催化是指通過質(zhì)子酸提供部分質(zhì)子,或是通過質(zhì)子堿接受部分質(zhì)子的作用，達(dá)到降低反應(yīng)活化能的過程。酶活性部位上的某些基團(tuán)可以作為良好的質(zhì)子供體或受體對底物進(jìn)行酸堿催化。His殘基的咪唑基是酶的酸堿催化作用中最活潑的一個催化功能團(tuán)。

廣義酸基團(tuán)廣義堿基團(tuán)（質(zhì)子供體）（質(zhì)子受體）四、決定酶特異性的機(jī)制（一）鎖鑰學(xué)說

1894年，E.Fischer最早提出的，是鎖頭和鑰匙的關(guān)系，一個底物一個酶，就象一條鑰匙一把鎖一樣。只能解釋絕對專一性，不能解釋相對專一性。（二）誘導(dǎo)契合學(xué)說特點：酶和底物原有的構(gòu)像并不是十分吻合，而是結(jié)合時才配對、契合，這就可解釋酶既可催化一個S，也可催化一類S發(fā)生反應(yīng)；既可催化正反應(yīng)，也可催化逆反應(yīng)，無論從那些方面來說都可解釋酶的特異性。要點：D.E.Koshland,1958年提出：酶的構(gòu)像并不是固定不變的，（特別是酶的活性中心的構(gòu)像），活性中心的構(gòu)象有柔性（是可變的，什么時候變？），當(dāng)S與酶結(jié)合時，底物誘導(dǎo)酶的活性中心的構(gòu)像發(fā)生有利于與底物結(jié)合的變化（從哪些方面變？），使反應(yīng)所需的催化基團(tuán)和結(jié)合基團(tuán)正確地排列和定向，轉(zhuǎn)入有效的作用位置，這樣才能使酶與底物完全吻合，結(jié)合成中間產(chǎn)物。+羥肽酶的誘導(dǎo)契合模式研究的內(nèi)容：是研究酶促反應(yīng)速度及其影響因素的科學(xué)。或者說：是研究各種因素對酶促反應(yīng)速度的影響，并加以定量的闡述的科學(xué)。影響因素包括有：酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等?！芯恳环N因素的影響時，其余各因素均恒定。第四節(jié)酶促反應(yīng)動力學(xué)

酶促反應(yīng)動力學(xué)研究的意義有助于闡明酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，也可為酶作用機(jī)理的研究提供數(shù)據(jù)；有助于尋找最有利的反應(yīng)條件，以最大限度地發(fā)揮酶催化反應(yīng)的高效率；有助于了解酶在代謝中的作用或某些藥物作用的機(jī)理等。

一、酶促反應(yīng)的速度酶促反應(yīng)速度：一定時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量。通常是用后者來表示，而且是測定反應(yīng)的初速度。102030405060min產(chǎn)物生成量酶反應(yīng)進(jìn)程曲線二、影響因素---溫度的影響影響的情況有兩個方面：酶的最適溫度——溫度既不過高以使酶失活，也不過低以使酶活力受到抑制，從而使酶表現(xiàn)出最大活力時的溫度。2、達(dá)到一定溫度時，溫度升高，反應(yīng)速度下降。是因為溫度升高（通常為600C時），酶蛋白變性，酶失去了活力。1、低溫時，溫度升高，反應(yīng)速度加快。一般的化學(xué)反應(yīng)中，溫度升高100C，反應(yīng)速度增加2~3倍即Q10為2-3，在酶促反應(yīng)中僅提高1~2倍。主要是增加了初動能。Tv最適溫度二、溫度的影響二、溫度的影響不同生物，在其他條件不變時，有一定的最適溫度，人體最適溫度370C，動物35-400C，植物和微生物32-600C。有另外：液化淀粉酶的最適溫度900C最適溫度不是酶的特征物理量。酶適合在低溫下保存（低溫時，活力低，但不失活）。三、PH的影響酶表現(xiàn)活性有一定的PH值范圍，也有最適PH值。酶的最適PH值——酶表現(xiàn)最大活力時的PH值。偏離了最適PH值，酶的活力降低；偏離了PH范圍，酶的活力喪失。0酶活性胃蛋白酶淀粉酶膽堿酯酶246810最適pH(optimumpH)：酶催化活性最大時的環(huán)境pH。三、PH的影響不同的酶有不同的最適PH值：人體及動物體內(nèi)大多數(shù)酶為中性：6.5—8.0，如血液中的酶為7.2—7.6，腸中的酶7.6-7.8，但有另外:胃酶為1.9，精氨酸酶為9.8。植物和微生物的最適PH值為4.5—6.5.酶一般放在緩沖液中保存。pH對酶作用的影響機(jī)制酶蛋白的結(jié)構(gòu)、酶活性部位的解離狀態(tài)、輔酶的解離、底物分子的解離。

從而影響酶與底物的結(jié)合以及對底物的催化效力。四、酶的濃度的影響在有足夠底物和其他條件不變的情況下：

v=k[E]EvK：反應(yīng)速度常數(shù)五、底物濃度的影響（一）影響的情況有三種（即分為三個階段）：1、[S]很低時，隨著[S]升高，v加快，且成直線關(guān)系，屬一級反應(yīng)；2、[S]一定量時，[S]升高，v加快，但比例下降，屬混合級反應(yīng)；3、[S]較高時，即[S]＞＞[E]，[S]升高，v不變（無所謂），屬零級反應(yīng)。[S]vVmax一級反應(yīng)

v=k[S]零級反應(yīng)

v=k[E]混合級反應(yīng)Km1/2Vmax1902年，VictorHenri發(fā)現(xiàn)：底物濃度對酶促反應(yīng)速度影響是非線性關(guān)系五、底物濃度的影響（二）米氏方程式（反映底物濃度[S]

應(yīng)速度v間的定量關(guān)系的公式）

v=——————Vmax·[S]km+[S]1913年Michaelis和Menten提出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即米－曼氏方程式，簡稱米氏方程式(Michaelisequation)。

根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說，酶促反應(yīng)分兩步進(jìn)行:(三)米氏方程的推導(dǎo)：當(dāng)反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時Km值的推導(dǎo)Km＝[S]∴Km值等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度，單位是mol/L。2＝Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2米氏常數(shù)是反應(yīng)最大速度一半時所對應(yīng)的底物濃度當(dāng)S<<Ｋm時，v正比于[Ｓ],呈一級反應(yīng)當(dāng)Ｓ>>Ｋm時，v＝Ｖm，呈零級反應(yīng)

米氏雙曲線四.米氏常數(shù)Km的意義:1.米氏常數(shù)的含義：由米氏方程可知，當(dāng)反應(yīng)速度等于最大反應(yīng)速度一半時,即V=1/2Vmax,Km=[S]

上式表示,米氏常數(shù)是反應(yīng)速度為最大值的一半時的底物濃度。因此,米氏常數(shù)的單位為mol/L。2.是酶的特征物理常數(shù)，但其應(yīng)用是有條件的：不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個重要的特征物理常數(shù)。Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測定的，不同條件下具有不同的Km值。3.表示酶與底物之間的親和程度：Km值表示酶與底物之間的親和程度：Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。4.判斷酶的最適底物

Km最小的底物5.計算一定速度下的底物濃度

V=80%Vmax時，(S)=？由：

0.8Km+0.8(S)=(S),0.8Km=0.2(S)(S)=4Km

又:V=99%Vmax,(S)=99Km6.了解酶的底物在體內(nèi)的濃度水平

Km≈(S)7.判斷反應(yīng)的方向

Km最小的反應(yīng)8.判斷抑制作用的類型（四）Km的求法1、雙倒數(shù)作圖法2、Eadie—Hofstee方程1.雙倒數(shù)作圖法

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax取米氏方程式的倒數(shù)形式即得米氏常數(shù)（Km）的測定測定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的作圖法—

雙倒數(shù)作圖法。1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km1/V

~

1/[S]作圖V/(S)VmaxVVmax/Km斜率=-Km2.Eadie-Hofstee方程由：V*[(Km+［S］)

/［S］]=VmaxV*Km/［S］

+V=VmaxV=-Km(V/［S］)+VmaxV

~

V/［S］作圖方程兩邊乘以(Km+［S］)/［S］3.Hanes作圖將雙倒數(shù)方程兩邊乘以（S）即得:

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax[S]Km1

=

+

[S]

V

VmaxVmax[S]/V∽[S][S][S]/V斜率=1/VmaxKm/Vmax四.雙底物雙產(chǎn)物反應(yīng)

A+B P+Q

雙底物雙產(chǎn)物的反應(yīng)按動力學(xué)機(jī)制可分為兩大類:

雙底物雙產(chǎn)物的反應(yīng)

序列反應(yīng)（sequentialreactions）

乒乓反應(yīng)（pingpongreactions）

有序反應(yīng)（orderdreactions）

隨機(jī)反應(yīng)（randomreactions）雙底物反應(yīng)AQPBEQEAB-EPQEEAEA+BP+QE（一）.順次反應(yīng)順次反應(yīng)：所有的底物都必須在反應(yīng)前以及產(chǎn)物釋放之前與酶結(jié)合的反應(yīng)1.有序順次反應(yīng)A,B與酶的結(jié)合是有順次的，不是隨機(jī)的，A不與酶結(jié)合，則B不能與酶結(jié)合如：NAD++CH3CH2OH----NADH+H++CH3CHOPBBAEBEAQEPQAEEPEQEAB-EPQ2.隨機(jī)順次反應(yīng)（二）.乒乓反應(yīng)AQBPE/

B=EQE/EEA=E/PEA，B哪個先與酶結(jié)合無關(guān)，P，Q哪個先釋放也不重要如：肌酸激酶(依賴ATP)主要特征：底物與酶的結(jié)合和產(chǎn)物的釋放是交替進(jìn)行的。如轉(zhuǎn)氨酶(依賴磷酸吡哆醛)六、激活劑對酶促反應(yīng)的影響1.概念：凡是能提高酶活力的物質(zhì)(簡單化合物)都稱為酶的激活劑,（activator)。2.成分：其中大部分是一些無機(jī)離子和小分子簡單有機(jī)物。如：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Cr2+、Fe2+、Cl-、Br-、I-、CN-、NO3-、PO4-、GSH、VitC等；如:

Mg2+對磷?；D(zhuǎn)移酶、脫羧酶，Cu2+對一些氧化酶，Cl-對唾液淀粉酶有激活作用。一些有機(jī)小分子:如VitC，谷胱甘肽，巰基乙醇等，巰基乙醇對巰基酶有激活作用。3.功能：1）.這些離子可與酶分子上的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)結(jié)合，可能是酶活性部位的組成部分，

2）.也可能作為輔酶或輔基的一個組成部分起作用；4.特點：1）.一般情況下，一種激活劑對某種酶是激活劑，而對另一種酶則不一定是激活劑，可能發(fā)生抑制作用；如：Mg2+對肌球蛋白腺三磷酸酶的活性有抑制作用2）.對于同一種酶，不同激活劑濃度會產(chǎn)生不同的作用。七抑制劑對酶作用的影響使酶的必需基團(tuán)或活性部位中的基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)改變而降低酶活力甚至使酶失活的物質(zhì)，稱為抑制劑。酶降低活性的情況有三種：1、失活作用——酶的活性喪失。原因：酶的高級結(jié)構(gòu)被破壞而變性。2、抑制作用——抑制酶的活性，使酶的活性全部或部分表現(xiàn)不出來。3、去激活作用——酶沒有變化，是去掉了激活劑，沒有激活劑酶的活性很低，如用金屬離子螯合劑——EDTA（乙二胺四乙酸鹽）去除金屬離子。從根本上來說沒有喪失活性，只是活性暫時無法表現(xiàn)出來。抑制劑導(dǎo)致酶的活力降低或喪失，使酶促反應(yīng)速度降低的作用稱為抑制作用。（一）抑制作用的概念抑制作用的特點a.在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與被抑制的底物分子或底物的過渡狀態(tài)相似。b.能夠與酶的活性中心以非共價或共價的方式形成比較穩(wěn)定的復(fù)合體或結(jié)合物。七抑制劑對酶作用的影響1.不可逆抑制作用：抑制劑與酶以共價鍵結(jié)合，不能通過超過濾或透析法除去抑制劑使酶的活性得到恢復(fù)。S+EESE+P+I↓EIE—SH+ICH2COOH→E—SCH2COOH+HI（二）抑制作用的類型

抑制劑作用于酶分子中的一類或幾類基團(tuán)，這些基團(tuán)中包含了必需基團(tuán)，因而引起酶失活。類型：

實例：有機(jī)磷殺蟲劑-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX路易士氣巰基酶失活的酶酸二巰基丙醇(BAL)

巰基酶BAL與砷劑結(jié)合物七抑制劑對酶作用的影響2、可逆抑制抑制劑與酶的活性中心或活性中心以外的基團(tuán)以非共價鍵結(jié)合，反應(yīng)是可逆的，即抑制劑可通過超過濾、透析法除去后使酶的活性得到恢復(fù)。七抑制劑對酶作用的影響（1）競爭性抑制：定義：抑制劑與底物的結(jié)構(gòu)相似，因而與底物競爭地與酶的活性中心結(jié)合，從而減少了酶的作用機(jī)會，降低酶的反應(yīng)速度。競爭的部位：是結(jié)合基團(tuán)（搶位置），抑制劑在結(jié)構(gòu)上與底物相似（條件相當(dāng)）。例子：丙二酸對琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制；

磺胺類藥物的抑制。抑制作用的特點：抑制作用的強(qiáng)弱取決于底物濃度與抑制劑濃度的比例。要排除抑制作用必須加大底物濃度（使抑制劑沒有市場）。動力學(xué)特點：與最大反應(yīng)速度無關(guān)，與米氏常數(shù)有關(guān)（抑制劑是可惡的第三者插足），只要有抑制劑的存在，酶與底物的結(jié)合下降，米氏常數(shù)會增大。酶的活性中心底物抑制劑產(chǎn)物底物和抑制劑能結(jié)合酶活性中心抑制劑阻止底物與酶的結(jié)合

在可逆的競爭性抑制中，抑制劑通常是酶的天然底物結(jié)構(gòu)上的類似物，兩者競爭酶的活性中心。*舉例1.丙二酸對琥珀酸脫氫酶的抑制琥珀酸琥珀酸脫氫酶FADFADH2延胡索酸2.磺胺藥對細(xì)菌FH2合成酶的抑制對氨基苯甲酸與對氨基苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶S+EESE+P+I↑↓EIv=———————V[S]km(1+[I]/ki)+[S]ki=[E][I]/[EI][S]vV/2kmkm′無I有I抑制作用的特點：抑制作用的強(qiáng)弱取決于底物濃度與抑制劑濃度的比例。要排除抑制作用必須加大底物濃度（使抑制劑沒有市場）。動力學(xué)特點：Vmax不變，Km增大。（抑制劑是可惡的第三者插足），只要有抑制劑的存在，酶與底物的結(jié)合下降，[I]濃度越高，S與E的結(jié)合能力越低，Km就越大。（2）非競爭性抑制：概念：酶可同時與底物及抑制劑結(jié)合，引起酶分子構(gòu)象變化，并導(dǎo)至酶活性下降。由于這類物質(zhì)并不是與底物競爭與活性中心的結(jié)合，所以稱為非競爭性抑制劑。如某些金屬離子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能與酶分子的調(diào)控部位中的-SH基團(tuán)作用，改變酶的空間構(gòu)象，引起非競爭性抑制。特點：抑制劑與酶活性中心外的必需基團(tuán)結(jié)合；抑制程度取決于［I］；非竟?fàn)幮砸种撇荒芡ㄟ^增大底物濃度的方法來消除。活性中心抑制劑位點抑制劑的結(jié)合不影響底物與酶的結(jié)合底物-酶-抑制劑復(fù)合物產(chǎn)物不能生成無抑制劑時產(chǎn)物生成非競爭性抑制作用的速度方程：有非競爭性抑制劑存在時，V值減小(1+[I]/Ki)倍，且V值隨[I]的增高而降低；Km值不變。非競爭性抑制作用的Lineweaver–Burk圖：

非競爭性抑制作用的動力學(xué)特點是Vmax變小，而Km不變。（3）反競爭性抑制：概念：酶只有在與底物結(jié)合后，才能與抑制劑結(jié)合，引起酶活性下降。反競爭性抑制可用下式表示：特點：抑制劑只與酶－底物復(fù)合物結(jié)合；抑制程度取決與抑制劑的濃度及底物的濃度；非竟?fàn)幮砸种撇荒芡ㄟ^增大底物濃度的方法來消除。有反競爭性抑制劑存在時，Km和V值均減小(1+[I]/Ki)倍，且都隨[I]的增高而降低。反競爭性抑制作用的速度方程：L-苯丙氨酸等一些氨基酸對堿性磷酸酶的作用是反競爭性抑制反競爭性抑制作用的Lineweaver–Burk圖：各種可逆性抑制作用的比較

第六節(jié)、酶的分離純化與酶活力測定一.酶的分離純化1.基本原則

提取過程中避免酶變性而失去活性防止強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和劇烈攪拌等要求在低溫下操作加入的化學(xué)試劑不使酶變性操作中加入緩沖溶液2.基本操作程序選材：微生物（微生物發(fā)酵物:胞內(nèi)酶，胞外酶），動物（動物器臟：消化酶，血液：SOD酶，尿液：尿激酶等）,植物（木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶等）。抽提：加入提取液提取。胞內(nèi)酶先要進(jìn)行細(xì)胞破碎（機(jī)械研磨，超聲波破碎，反復(fù)凍融或自溶等），分離：先進(jìn)行凈化處理（過濾，絮凝，離心脫色），再采用沉淀法分離（鹽析法，有機(jī)溶劑沉淀法，超離心等）。純化：可采用離子交換層析，凝膠過濾，液相色譜，親和色譜和超濾等方法。3.酶的制劑形式固體：干燥（冰凍升華，噴霧干燥，真空干燥）液體：溶液4.保存低溫下短期保存0-4℃（固體）-20?-70℃（液體）二.酶活力及其測定方法（一）.酶活力概念酶活力：又稱為酶活性，酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱為酶活力，。（二）.酶活力的表示方法-酶活力單位(unit,U)

規(guī)定條件（最適條件）下一定時間內(nèi)催化完成一定化學(xué)反應(yīng)量(底物的減少量/產(chǎn)物的增加量)所需的酶量(質(zhì)量)。1.酶活力單位的基本定義酶活力通常以在一定條件下酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速度來表示。反應(yīng)速度可用單位時間內(nèi)單位體積中底物的減少量/產(chǎn)物的增加量表示.酶活力∝反應(yīng)速度∝底物的減少量/產(chǎn)物的增加量2.國際單位IU（internationalUnit）：在最佳條件或某一固定條件下每分鐘催化生成1μmol產(chǎn)物(消耗1μmol底物)所需要的酶量為一個酶活力單位?！癒atal”單位：是指在一定條件下1秒鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1mol底物所需的酶量。Kat和U的換算關(guān)系：1Kat=6×107U，1U=16.67nKat

如果底物有一個以上可被作用的化學(xué)鍵，則一個酶單位表示1分鐘使1μmol有關(guān)基團(tuán)轉(zhuǎn)化的酶量。如果是兩個相同的分子參加反應(yīng)，則每分鐘催化2μmol底物轉(zhuǎn)化的酶量稱為一個酶單位。

在“U”和“kat”酶活力單位的定義和應(yīng)用中，酶催化底物的分子量必須是已知的，否則將無法計算。3.酶活力單位某些習(xí)慣表示法在實際使用中，不同酶有各自的規(guī)定，如：DNA限制性內(nèi)切酶：推薦反應(yīng)條件下，一小時內(nèi)可完全消化1μg純化的DNA所需的酶量為一個酶單位。

。α-淀粉酶活力單位：每小時分解1g可溶性淀粉的酶量為一個酶單位。也有規(guī)定每小時分解1mL2%可溶性淀粉溶液為無色糊精的酶量為一個酶單位。糖化酶活力單位：在規(guī)定條件下，每小時轉(zhuǎn)化可溶性淀粉產(chǎn)生1mg還原糖（以葡萄糖計）所需的酶量為一個酶單位。蛋白酶：規(guī)定條件下，每分鐘分解底物酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量為一個酶單位。4.酶的比活力比活力:指每mg酶蛋白質(zhì)/蛋白氮所含的酶活力單位數(shù)。比活力=U或Kat/mg酶蛋白或蛋白氮(U或Kat/ml酶液,或U或Kat/mg酶制劑）比活力表示酶制劑的純度的一個指標(biāo)。5.酶活力中心轉(zhuǎn)換數(shù)酶活力中心轉(zhuǎn)換數(shù)Kcat:表示酶的最大催化的活性的一種量度,又稱酶的分子活性。單位時間內(nèi)(sec.)每一催化中心的活性或活性中心所能轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)，或每mol酶活性中心單位時間轉(zhuǎn)換底物的mol數(shù).轉(zhuǎn)換數(shù)=k3=Vmax/(Et)1M酶活性中心單位時間內(nèi)轉(zhuǎn)換底物的摩爾數(shù)([S]/M)6.回收率和純化倍數(shù)回收率=純化倍數(shù)=每次活力第一次活力每次比活力第一次比活力*100%純化步驟總蛋白（mg）活力IU比活力IU/mg回收率%純化倍數(shù)勻漿液1.4*1062.8*10621001等電點沉淀4*1041.4*106355017.5DEAE柱色譜8*1031*1061253662.5（三）.酶活力測定酶活力測定就是測定一定量的酶，在單位時間內(nèi)產(chǎn)物的生成（增加）量或底物的消耗（減少）量。即測定時確定三種量：

①加入一定量的酶；②一定時間間隔；③物質(zhì)的增減量。1.測定酶活力的方式反應(yīng)計時法：測定完成一定量反應(yīng)所需的時間。反應(yīng)計時必須準(zhǔn)確。反應(yīng)體系必須預(yù)熱至規(guī)定溫度后，加入酶液并立即計時。反應(yīng)到時，要立即滅酶活性，終止反應(yīng)，并記錄終了時間。終止酶反應(yīng)。反應(yīng)量的測定法：測定單位時間內(nèi)酶催化的化學(xué)反應(yīng)量。測底物減少量或產(chǎn)物生成量均可。在反應(yīng)過程中產(chǎn)物是從無到有，變化量明顯，極利于測定，所以大都測定產(chǎn)物的生成量2.酶活力測定的分析方法具體物質(zhì)量的測定，據(jù)被測定物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)通過定量分析法測定。光譜分析法：酶將產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄖ苯踊蜷g接）一個可用分光光度法或熒光光度法、酶偶聯(lián)法測出的化合物?；瘜W(xué)法：利用化學(xué)反應(yīng)使產(chǎn)物變成一個可用某種物理方法測出的化合物，然后再反過來算出酶的活性，如PH測定法。放射性化學(xué)法：用同位素標(biāo)記的底物，經(jīng)酶作用后生成含放射性的產(chǎn)物，在一定時間內(nèi)，生成的放射性產(chǎn)物量與酶活性成正比。

常用的方法有：

第七節(jié)酶的多樣性（自學(xué)）一.多酶復(fù)合體：由幾個功能相關(guān)的酶嵌合而成的復(fù)合體。二.同工酶：指分子結(jié)構(gòu)及性質(zhì)不同，但能催化同一反應(yīng)的一類酶

HHHHHHHMHHMMHMMMMMMMLDH1

(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5

(M4)乳酸脫氫酶的同工酶*舉例：乳酸脫氫酶(LDH1～

LDH5)心肌肝臟骨骼肌腎臟紅細(xì)胞乳酸脫氫酶同工酶形成示意圖

多