分光光度法測定豆粕和米糠中的植酸含量

分光光度法測定豆粕和米糠中的植酸含量

植物含有碳?xì)浠衔?.54和椰子的化學(xué)特征。屬于維生素b型。格式為c6h182864p6，分子量為660.04。這是一種天然含有少量磷的有機化合物。它存在于許多水果和植物中，但葉片中含量較低。它是谷物、豆類和油種子中磷的主要儲存形式（占種子總磷含量的60%以上），在種子的正常生長中起著重要作用。其中以米糠中含量最高,占9.5%~14.5%。植酸具有較強的螯合作用,曾一度認(rèn)為它是抗?fàn)I養(yǎng)因子,而僅被應(yīng)用于日?；ゎI(lǐng)域,但近幾年國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)植酸作為天然無毒的抗氧化劑在保鮮、抗氧化、防止自由基傷害與脂質(zhì)過氧化損傷、抗腫瘤等方面都有肯定性的意義,因此,營養(yǎng)學(xué)界掀起了植酸研究的熱潮。農(nóng)副產(chǎn)品中植酸含量的測定方法是科學(xué)界一直關(guān)注的問題。目前,已經(jīng)用于測定食品中植酸的方法有測磷分光光度法、測鐵分光光度法、高效液相色譜法和硝酸釷滴定法。硝酸釷滴定法結(jié)果偏高;測磷分光光度法采用磷酸二氫鉀為標(biāo)準(zhǔn),測定準(zhǔn)確度高,精密度好,但消化較麻煩;高壓液相色譜法采用植酸為標(biāo)準(zhǔn),測定結(jié)果準(zhǔn)確,但儀器昂貴,適用于有植酸標(biāo)準(zhǔn)品的測定和科研及產(chǎn)品的準(zhǔn)確分析;測鐵分光光度法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、不需消化,適用于研究與實際生產(chǎn)中。1植酸含量測定用陰離子交換樹脂將植酸和植酸鹽吸附,使之與無機磷及其鹽類等雜質(zhì)分離,用氯化鈉溶液洗脫,洗脫液中的植酸與三氯化鐵-磺基水楊酸混合液作用,產(chǎn)生褪色反應(yīng),植酸含量與褪色程度成正比,用分光光度計在波長500nm處測定吸光度,計算樣品植酸含量。2材料和方法2.1試驗方法和儀器豆粕,米糠(過40目篩);201×7強堿性陰離子交換樹脂及D201大孔陰離子交換樹脂(購于上海華羚樹脂有限公司);三氯化鐵-磺基水楊酸反應(yīng)溶液:稱取0.6g三氯化鐵和6g磺基水楊酸,加蒸餾水溶解并定容至200mL,使用前以水稀釋10倍;植酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取1.6682g植酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品(純度97%,Sigma公司),精確至0.0001g。加蒸餾水溶解并定容至100mL。使用前,吸取5mL用蒸餾水定容至500mL,其濃度為0.1mg/mL;鹽酸、氫氧化鈉、氯化納等其它化學(xué)試劑均為分析純。恒溫水浴震蕩器;離子交換柱:0.8cm×10cm;離心機;722型分光光度計。2.2實驗方法(1)硫酸鈉-5%三氯乙酸提取溶液4g/l稱取均質(zhì)樣品1g,精確至0.0001g,置于250mL具塞三角瓶中,加入10%硫酸鈉-5%三氯乙酸提取溶液50mL,振蕩提取一定時間后過濾,收集濾液定容到100mL或200mL。(2)在預(yù)處理液中浸泡2%h稱取5g陰離子交換樹脂,浸于蒸餾水中2h,再用3倍量的4%氫氧化鈉溶液浸泡1h,然后浸泡于3倍量的4%鹽酸溶液1h,最后用蒸餾水沖洗,浸泡于蒸餾水中備用。(3)樣品處理和洗滌劑制備將經(jīng)過預(yù)處理的陰離子樹脂濕法填裝于交換柱中,用去離子水洗滌交換柱至無氯離子(加入1mol/L硝酸銀—硝酸溶液,與去離子水對照)。取10mL樣品提取液,加30g/L氫氧化鈉溶液1mL,補加蒸餾水至總體積30mL,混勻后倒入離子交換柱中。然后分別用15mL水和15mL0.05mol/L氯化鈉洗滌溶液以1mL/min的流速洗滌交換柱,棄去洗滌液。最后用0.7mol/L氯化鈉洗脫溶液洗脫交換柱,收集于25mL刻度具塞試管中,并定容至刻度。(4)工作曲線工作曲線的制作:精確吸取0.1mg/mL植酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于六只10mL離心管中,用蒸餾水補足至5mL,加入三氯化鐵-磺基水楊酸反應(yīng)溶液4mL,搖勻,以3000r/min轉(zhuǎn)速離心10min,放置15min后,將上層液倒入比色皿中,于500nm處測定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),植酸含量為橫坐標(biāo),繪制工作曲線并計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。試液測定:取洗脫液2~5mL于10mL離心管中(根據(jù)洗脫液中的植酸量而定),加水補足至5mL,再加入三氯化鐵-磺基水楊酸反應(yīng)溶液4mL,搖勻,其余步驟同工作曲線的制作,測其吸光度,并在工作曲線上查得或從回歸方程計算出試液中植酸含量。(5)分離液體積測定式中:X—樣品中植酸含量,mg/g;C—樣液含植酸量,mg;m—樣品的質(zhì)量,g;V1—提取液定容后的體積,mL;V2—分離后,取提取液的體積,mL;V3—分離液定容后的體積,mL;V4—試液測定時,取分離液的體積,mL。3結(jié)果與分析3.1種植酸的曲線3.2預(yù)分離、分離植酸首先以米糠為研究對象,確定植酸提取、分離的最佳條件,然后應(yīng)用最佳條件同時測定米糠和豆粕中植酸含量。稱取1g米糠加入50mL提取液,室溫(25℃)下震蕩提取2h,過濾,蒸餾水定容至200mL。然后進(jìn)行植酸的分離、測定,樹脂量為5g,濕法裝柱,吸附與洗脫速度為1mL/min,作兩次平行試驗(見表1)?？梢?D201大孔強堿性陰離子交換樹脂分離植酸的效果明顯優(yōu)于201×7強堿性陰離子交換樹脂。因此,選定D201大孔強堿性陰離子交換樹脂進(jìn)行植酸分離。3.3各因素對米糠中植酸含量測定的正交試驗結(jié)果選定D201大孔陰離子交換樹脂為分離樹脂后,提取時間、提取溫度及吸附洗脫流速是影響植酸含量測定結(jié)果的主要因素,因此,對這三個因素進(jìn)行正交試驗,確定植酸含量測定的最佳條件(見表2、3)。由分析結(jié)果可以看出,各因素對米糠中植酸含量測定影響強弱的順序為B>A>C,即提取時間>提取溫度>流速,且提取時間與提取溫度影響顯著,而流速影響不顯著;最佳因素水平組合為A2B3C1。采用最佳因素水平組合進(jìn)行重復(fù)試驗測定米糠中的植酸含量,同時測定豆粕中的植酸含量,其結(jié)果見表4。4通插裝劑為7強堿性陰離子交換樹脂,其在使用時長為9.GB/T5009.153-2003,植物性食品中植酸的測定,使用的是AG1-X4陰離子交換樹脂,為擴(kuò)大我國樹脂的應(yīng)用范圍,本研究采用了201×7強堿性陰離子交換樹脂和D201大孔陰離子交換樹脂進(jìn)行植酸分離的對比研究。D201大孔陰離子交換樹脂分離植酸的效果明顯優(yōu)于201×7強堿性陰離子交換樹脂。其原因可能是大孔吸附樹脂包含許多具有微觀小球組成的網(wǎng)狀孔穴結(jié)構(gòu),因此顆粒的總表面積很大,加上合成時引入了極性基團(tuán),使大孔樹脂具有較大的吸附能力。這些網(wǎng)狀孔穴在合成樹脂時具有一定的孔徑,使得它們對通過孔徑的化合物根據(jù)其分子量的不同而具有一定的選擇性,另一方面,從性能上來看,D201大孔陰離子交換樹脂比201×7強堿性陰離子交換樹脂具有更好的物理及化學(xué)穩(wěn)定性。當(dāng)植酸含量在0~0.5mg范圍內(nèi)時,植酸含量與吸光度相關(guān)性很好,r=0.9998,超過此范圍相關(guān)性明顯下降,因此,測定植酸時要注意試