結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)及相關(guān)內(nèi)容

控制結(jié)核

人人有責(zé)3月24日是第13個(gè)“世界防治結(jié)核病日”，今年衛(wèi)生部的宣傳主題是“控制結(jié)核、人人有責(zé)”。疾病預(yù)防控制中心提出，目前結(jié)核病仍然是嚴(yán)重危害人類健康的主要傳染病之一，75%的病人為中青年，每年死亡13萬(wàn)人。結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)及相關(guān)內(nèi)容張東華一、結(jié)核名稱的由來(lái)

結(jié)核病是一種古老的疾病，也許有了人類不久就已有了它的存在。1973年，湖南長(zhǎng)沙馬王堆漢墓出土的2100年前的女尸身上發(fā)現(xiàn)左上肺門(mén)均有結(jié)核病灶。1965年，法國(guó)學(xué)者Sylvius根據(jù)解剖了死于所謂“消耗病”或“癆病”人的尸體，發(fā)現(xiàn)肺臟及其它器官有顆粒狀的病變，根據(jù)其形態(tài)特征稱之為“結(jié)核”。因而，結(jié)核的名稱就此而被應(yīng)用至今。二、結(jié)核病

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染病，可以侵及很多臟器，以肺部受累形成肺結(jié)核〔pulmonarytuberculosis〕最為常見(jiàn)；其次有腸結(jié)核、淋巴結(jié)結(jié)核、泌尿系結(jié)核、骨結(jié)核、結(jié)核性腦膜炎、全身粟粒性結(jié)核、結(jié)核性腹膜炎等。三、我國(guó)結(jié)核病疫情現(xiàn)狀

據(jù)2000年全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)結(jié)核病疫情現(xiàn)狀為：

（1）結(jié)核病感染率高：目前全年齡組結(jié)核菌感染率為44.5%，全國(guó)約5.5億人受到了結(jié)核菌感染，結(jié)核菌感染率高于全球人口感染率為1/3的水平。

（2）結(jié)核病患病率高：全國(guó)活動(dòng)性肺結(jié)核患病率為367/10萬(wàn)，涂陽(yáng)肺結(jié)核患病率為122/10萬(wàn)，菌陽(yáng)肺結(jié)核患病率為160/10萬(wàn)；估算全國(guó)現(xiàn)有活動(dòng)性肺結(jié)核病人數(shù)450萬(wàn)，其中涂陽(yáng)肺結(jié)核病人150萬(wàn)，菌陽(yáng)肺結(jié)核病人200萬(wàn)。

（3）結(jié)核病耐藥率高：肺結(jié)核病人結(jié)核菌初始耐藥率為18.6/10萬(wàn),繼發(fā)耐藥率為46.5/10萬(wàn)。按照全國(guó)菌陽(yáng)肺結(jié)核病人200萬(wàn)計(jì)算，全國(guó)有耐藥病人55.5萬(wàn)。

（4）結(jié)核病死亡率高：全國(guó)結(jié)核病死亡專率為9.8/10萬(wàn),每年因結(jié)核病死亡13萬(wàn)人，為各種其他傳染病和寄生蟲(chóng)病死亡總和的2倍。四、肺結(jié)核的主要癥狀肺結(jié)核是由結(jié)核桿菌引起的一種慢性肺部感染性疾病。病初有輕微咳嗽或咯痰，或有四肢結(jié)節(jié)性紅斑。部分病人表現(xiàn)為胸痛、咯血。常見(jiàn)的全身癥狀有周身不適，精神萎靡，易倦乏力，性情煩躁，心悸，食欲減退，體重減輕，盜汗，不規(guī)則低熱，兩顴潮紅，婦女月經(jīng)不調(diào)。也有無(wú)明顯癥狀，僅在胸部X線健康檢查時(shí)才被發(fā)現(xiàn)。在慢性病程中，病情惡化，可有高熱畏寒，紫紺氣促，肺萎縮，肺氣腫，滲出性胸膜炎，胸膜增厚等。本病的病因與結(jié)核桿菌感染因素有關(guān)。本病主要診斷依據(jù)結(jié)合局部和全身癥狀。痰液檢查找到結(jié)核桿菌可確診。

五、結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法（一）涂片檢查（二）分離培養(yǎng)（三）動(dòng)物試驗(yàn)（四）基因診斷結(jié)核分枝桿菌檢驗(yàn)程序（一）標(biāo)本的收集及直接涂片法1.痰標(biāo)本最好為清晨第一口痰，潔凈水或冷開(kāi)水漱口后，用力咳嗽以獲得2-3ml痰液置于標(biāo)本盒內(nèi)，直接涂2.0cm×2.5cm的卵圓形痰膜，自然干燥后抗酸染色鏡檢即可。涂片應(yīng)使用干凈無(wú)劃痕的新玻片。痰標(biāo)本不能使用蠟盒，因?yàn)槠淇蓪?dǎo)致涂片結(jié)果假陽(yáng)性。

2.尿液留取12小時(shí)尿液，靜置，傾去上清，留取沉淀部分30ml，以3000r/min離心30min，棄上清，取沉淀物涂片.3.腦脊液無(wú)菌收集腦脊液，放置24小時(shí)后，取網(wǎng)膜狀蛋白質(zhì)涂片，或以3000r/min離心30min，取沉淀物涂片。4.胸腹水與尿液同。5.胃液標(biāo)本將標(biāo)本置冰箱內(nèi)20分鐘，取濃厚部分進(jìn)行涂片。6.病灶組織：先用組織磨碎器磨碎后，同痰標(biāo)本涂法。（二）集菌涂片法取深咳痰10ml于消毒處理過(guò)的廣口瓶中，加5倍量的無(wú)菌蒸餾水，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，待用。離心集菌法：取上述痰液10ml放入50ml離心管內(nèi)加蒸餾水至50ml，3000r/min離心30min，取沉淀物涂片。漂浮集菌法：取上述痰液10ml放入100ml細(xì)口玻璃容器內(nèi)，加蒸餾水30ml，加入二甲苯0.3ml，振蕩10min，加蒸餾水至滿，靜置15min，取載玻片蓋于瓶口，靜置15min，取下玻片，干后染色。目前我們實(shí)驗(yàn)室采用BaSO溶痰劑與痰檢體2：1或3：1混合均勻，靜置10~20min，待其完全溶化，離心取沉淀涂片染色。簡(jiǎn)化了操作過(guò)程。（三）染色方法

1.抗酸染色第一液：堿性復(fù)紅乙醇溶液10ml5％石炭酸溶液90ml

第二液：濃鹽酸3ml95％乙醇97ml

第三液：美藍(lán)乙醇飽和溶液100ml10％KOH0.1ml

蒸餾水100ml

染色步驟：⑴涂片經(jīng)火焰固定后加第一液約5min，水洗。⑵第二液脫色，至涂片無(wú)紅色脫出為止，水洗。⑶第三液復(fù)染約30s，水洗，自然干燥后鏡檢。結(jié)果：抗酸桿菌呈紅色，背景為藍(lán)色。報(bào)告方式；﹙

﹚未發(fā)現(xiàn)抗酸菌/300個(gè)油鏡視野

(±)1～

2個(gè)抗酸菌/300個(gè)油鏡視野

(1+)3～9個(gè)抗酸菌/100個(gè)油鏡視野

(2+)10～99個(gè)抗酸菌/100個(gè)油鏡視野

(3+)1～10個(gè)抗酸菌/每個(gè)油鏡視野

(4+)＞10個(gè)抗酸菌/每個(gè)油鏡視野2.熒光染色法（金胺O法）（1）染色劑：金胺0.01g溶于95％乙醇

10ml內(nèi)，加5％

石炭酸至100ml。

脫色劑：3％

鹽酸乙醇。

復(fù)染劑：0.5％

高錳酸鉀水溶液。（2）染色步驟：痰涂片火焰固定，加染色劑，10~15分鐘水洗。脫色劑脫色3~5分鐘，至無(wú)黃色，水洗。復(fù)染劑染2分鐘，水洗，干后用熒光顯微鏡鏡檢。

（3）結(jié)果：結(jié)核分枝桿菌呈金黃色熒光。如下圖。（二）分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)一般使用羅-琴培養(yǎng)基、米氏TH10培養(yǎng)基、L-J培養(yǎng)基或T2H培養(yǎng)基。生長(zhǎng)緩慢，用羅-琴培養(yǎng)基培養(yǎng)2~6W方可見(jiàn)到菌落。菌落多為粗糙型，不透明，乳白色或米黃色，呈干燥顆粒狀，形似菜花。生物學(xué)特性：結(jié)核分枝桿菌是分枝桿菌屬內(nèi)對(duì)人類及動(dòng)物致病的主要病原菌。典型的結(jié)核分枝桿菌的形態(tài)為細(xì)長(zhǎng)稍彎曲或直的，兩端圓鈍的桿菌，長(zhǎng)1～4微米，寬0.3～0.6微米，單個(gè)散在，有時(shí)呈X、Y形或條索狀。痰標(biāo)本涂片經(jīng)過(guò)抗酸染色后在100倍的生物顯微鏡下可以看到。結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，為尋找一種快速、簡(jiǎn)便、成本低廉的培養(yǎng)方法，Vasauthor等用含椰子汁和馬血清的培養(yǎng)基使培養(yǎng)時(shí)間縮短至6d。也有人采用以新鮮椰子水、人血漿、甘油等混合組成的液體培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱CPG)建立一種快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、可靠的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)方法。CPG陽(yáng)性平均時(shí)間9d。另外，美國(guó)BD公司開(kāi)發(fā)的BACTECTMMGITTM960分枝桿菌培養(yǎng)/鑒定/藥敏系統(tǒng)，陽(yáng)性標(biāo)本檢出時(shí)間：是目前全球最快的分枝桿菌培養(yǎng)、鑒定、藥敏系統(tǒng)。分枝桿菌快速培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本檢出時(shí)間平均為9天；鑒定、藥敏試驗(yàn)時(shí)間平均為4天。系統(tǒng)功能：具備分枝桿菌快速培養(yǎng)、藥敏、鑒定試驗(yàn)三項(xiàng)功能配套。藥敏試劑：可提供配套異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素四種藥物抑菌濃度、殺菌濃度藥敏試驗(yàn)。標(biāo)本范圍：包括痰、胸腹水、體液、腦脊水、體液、腦脊液、組織塊狀標(biāo)本及其它非血液標(biāo)本。什么情況下應(yīng)對(duì)病人進(jìn)行痰結(jié)核菌培養(yǎng)？

盡管痰結(jié)核菌培養(yǎng)不是作為傳染源診斷的主要方法，但結(jié)果可信度高，并能做結(jié)核菌藥敏試驗(yàn)。所以當(dāng)病人痰涂片檢查陰性，需要進(jìn)一步進(jìn)行鑒別診斷時(shí)，如果痰培養(yǎng)陽(yáng)性能確診為肺結(jié)核病人。還有一些病人經(jīng)抗結(jié)核藥物治療失敗需要進(jìn)行結(jié)核菌的菌型鑒定和藥敏性試驗(yàn)時(shí)也必須進(jìn)行痰培養(yǎng)。目前痰培養(yǎng)有許多方法，傳統(tǒng)的改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)方法需要4-8周才能報(bào)告結(jié)果。目前像Bactec等快速培養(yǎng)法可使時(shí)間縮短至5-7天報(bào)告結(jié)果，也可作藥敏試驗(yàn)。關(guān)于新鮮和陳舊標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法的探討

為了選擇一種方便的檢測(cè)方法，有人采用了抗酸染色、細(xì)菌培養(yǎng)、熒光染色、聚合酶聯(lián)反應(yīng)（PCR）4種方法分別檢測(cè)陳舊標(biāo)本和新鮮標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌，結(jié)果如下：新鮮標(biāo)本抗酸染色、細(xì)菌培養(yǎng)、熒光染色、PCR4種方法陽(yáng)性率分別為30.6%、36.6%、48.2%、50%;陳舊標(biāo)本分別為24.8%、31.8%、45.7%和0。結(jié)果顯示，PCR檢測(cè)新鮮標(biāo)本中的MTB敏感性最高，與抗酸染色比較，差異有顯著性（P<0.05），但不能檢測(cè)陳舊標(biāo)本中的MTB?？赡苁荘CR擴(kuò)增技術(shù)需要標(biāo)本的脫氧核糖核酸有較高活動(dòng)性，熒光染色在新舊兩種標(biāo)本中均有較高敏感性?？傊迈r標(biāo)本可用于抗酸染色和細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)，但敏感性低。熒光染色對(duì)新舊標(biāo)本檢測(cè)均可獲可靠結(jié)果，可能是由于熒光素穩(wěn)定，發(fā)光使信號(hào)放大，在熒光顯微鏡下更容易觀察。PCR對(duì)新鮮標(biāo)本敏感性高，但對(duì)放置過(guò)久的標(biāo)本不能發(fā)揮作用，因此應(yīng)盡快處理采集的標(biāo)本，方可獲得可靠結(jié)果。六、結(jié)核分枝桿菌的抵抗力與消毒

結(jié)核分枝桿菌和普通細(xì)菌比較，對(duì)物理和化學(xué)的消毒與滅菌方法具有比較強(qiáng)的抵抗力。因此，有些消毒劑對(duì)普通細(xì)菌有比較強(qiáng)的殺菌效果，而對(duì)結(jié)核分枝桿菌的消毒效果比較差或無(wú)消毒作用。結(jié)核分枝桿菌常用的物理消毒方法

（1）煮沸消毒：一般含有結(jié)核桿菌的物品，應(yīng)該持續(xù)煮沸10分鐘以上才能殺死全部的結(jié)核分枝桿菌，達(dá)到完全滅菌的效果。所以，患者在家中的痰紙、廢紙、痰均可采用火燒消毒。

（2）高壓蒸氣滅菌：是普遍應(yīng)用的滅菌效果最好的消毒方法；在121.3℃（1.05kg/cm2）持續(xù)30分鐘的消毒處理是結(jié)核分枝桿菌及其污染物的最安全最徹底的消毒滅菌方法。

（3）紫外線消毒：結(jié)核分枝桿菌對(duì)紫外線具敏感性。主要指日光內(nèi)的紫外線和紫外線滅菌燈。痰標(biāo)本涂片在直射的太陽(yáng)光下照射2～7小時(shí)，可以殺死結(jié)核分枝桿菌，對(duì)結(jié)核患者的衣物、被褥等用品，采用太陽(yáng)光照射的簡(jiǎn)單消毒法是有效的。尤其是在晴朗的夏天，經(jīng)過(guò)太陽(yáng)3～4小時(shí)的照射，可以完全達(dá)到消毒效