酶組織化學(xué)各論

酶組織化學(xué)各論一、堿性磷酸酶

堿性磷酸酶在堿性環(huán)境下能催化各種醇和酚的磷酸酯水解。其反應(yīng)通式如下：1.鈣-鈷法光鏡顯示方法

（1）鈣-鈷法的原理堿性磷酸酶將磷酸鹽的底物分解產(chǎn)生磷酸離子為孵育液中的氯化鈣捕獲生成磷酸鈣沉淀，加入硝酸鈷，使之轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿徕挸恋恚偻ㄟ^硫化銨處理，形成棕黑色硫化鈷顆粒沉淀，以顯示酶活性所在部位。（2）孵育液的配制：

3％β-甘油磷酸鈉10ml（底物）

2％巴比妥鈉10ml（緩沖液）

2％氯化鈣20ml（捕獲劑）

5％硫酸鎂5ml（激活劑）

D.W5ml

孵育液最終pH值9.4，置于冰箱保存。

（3）操作步驟：

①新鮮組織，作冰凍切片（可用10％福爾馬林

固定10min，或不固定）

②入孵育液，37℃孵育30～60min

（磷酸鈣沉淀形成）

③蒸餾水沖洗5min

④置2％硝酸鈷內(nèi)2min（磷酸鈷形成）

⑤蒸餾水沖洗

⑥置1％硫化銨溶液內(nèi)1min（硫化鈷形成）

⑦蒸餾水沖洗

⑧甘油明膠封固（非脂溶劑穩(wěn)定沉淀）（4）結(jié)果與評價：堿性磷酸酶活性產(chǎn)物為棕黑色硫化鈷沉淀。該法的反應(yīng)產(chǎn)物可發(fā)生擴散，故定位欠準確。

（5）對照：從孵育液中去除底物或用左旋咪唑等抑制劑的方法。2.偶氮-偶聯(lián)法光鏡顯示方法

（1）偶氮色素法的原理偶氮色素法是捕捉與磷酸同時釋放出的醇或酚，以偶氮色素的形式產(chǎn)生沉淀的方法。如底物使用β－磷酸萘酯，通過酶的作用，水解生成的β－萘酚，后者為重氮鹽捕捉，生成紅色的偶氮色素沉淀。（2）孵育液的配制：

萘酚AS（或萘酚AS-MX）10～25mg（底物）

N，N-二甲基甲酰胺液

0.5ml（促溶劑）

0.2mol/LTris－鹽酸（pH9.2）

50ml（緩沖液）

堅牢藍B

50mg（捕獲劑）

以上混合和過濾，必要時可用氫氧化鈉調(diào)整pH9.0～9.2值。

（3）操作步驟：

①新鮮組織，作冰凍切片；

②入孵育液，37℃或室溫

5～60min

（有色沉淀形成）

③雙蒸餾水沖洗3～5min

④4％甲醛，室溫下固定10～50min

⑤蒸餾水沖洗

3～5min

⑥甘油明膠封固。（脂溶性沉淀）

（4）結(jié)果與評價：采用不同的重氮鹽，酶的活性顯色也不同

萘酚法有三個優(yōu)點：①反應(yīng)產(chǎn)物溶解度小，局部比較明顯；②萘酚化合物能比較快地被水解，可縮短孵育的時間；③反應(yīng)產(chǎn)物立即可見，并顯示出顏色。3.檸檬酸鉛電鏡顯示法

（1）預(yù)處理：

①固定：2％戊二醛（0.1mol／L二甲胂酸緩沖液，8％蔗糖，PH7.2～7.4），固定60min；或4％多聚甲醛固定數(shù)小時至12h。

②切片：冰凍切片機或振動切片機切片40～50um。（2）孵育液的配制：

0.2mol／LTris-HCl（pH8.5）

1.4ml（緩沖液）

3％β-甘油磷酸鈉2.0ml（底物）

0.015mol／LMgSO4液2.6ml（激活劑）

蔗糖0.5g（和緩劑）

0.5％檸檬酸鉛4.0ml（捕獲劑）

共計10ml（pH9.0～9.4）（3）方法與步驟：

①新鮮組織，或甲醛固定并作冰凍切片40um；

②入孵育液，37℃，孵育15～30min；

③蒸餾水洗；

④冷1％鋨酸（OsO4），30min；

⑤蒸餾水洗；

⑥梯級酒精脫水；

⑦環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，電子染色；

⑧電子顯微鏡觀察。（4）結(jié)果與評價：磷酸鉛呈現(xiàn)高電子密度顆粒，主要分布在細胞膜上。

（5）對照：孵育液中去除底物或加入抑制劑（如β苯丙氨酸或四唑或溴四唑），則酶活性為陰性。二、酸性磷酸酶

酸性磷酸酶是一種在酸性環(huán)境下能水解磷酸單酯的酶。其反應(yīng)通式與堿性磷酸酶相同。

酸性磷酸酶活性的檢查法一般可分為金屬鹽法和偶氮色素法。1.金屬鹽光鏡顯示方法

（1）顯示原理

顯示酸性磷酸酶的鉛法其基本機制類似于顯示堿性磷酸酶的鈣-鈷法，但因磷酸鈣在酸性溶液中是可溶性化合物，故改用硝酸鉛作捕獲劑，最后與硫化銨作用生成棕色硫化鉛沉淀。（2）孵育液的配制：

3％β-甘油磷酸鈉1ml（底物）0.05mol醋酸鹽緩沖液（pH5.0）

10ml（緩沖液）

蔗糖0.8mg（和緩劑）

硝酸鉛10mg（捕獲劑）

孵育液最終pH值5.0，新鮮配制盡快使用。（3）操作步驟：

①新鮮組織，作冰凍切片或石蠟切片

②10％福爾馬林固定10min

③蒸餾水洗

④入孵育液，37℃2～4h（磷酸鉛形成）

⑤雙蒸餾水洗2～3min

⑥入1％硫化銨液（新鮮配制）1～2min

（硫化鉛形成）

⑦蒸餾水沖洗；

⑧甘油明膠封固。（非脂溶劑穩(wěn)定沉淀）（4）結(jié)果與評價：反應(yīng)陽性部位呈棕褐色硫化鉛顆粒。該酶是可溶性酶，以冷固定后結(jié)果較滿意。

（5）對照：①去底物對照；②抑制劑對照：特異性酶抑制劑是氟化鈉（NaF，4.2mg／10ml）。2.偶氮色素光鏡顯示方法

（1）顯示原理

酸性磷酸酶是使底物的醇部分脫磷酸化，以偶氮色素的形式捕捉。以萘酚或其衍生物磷酸酯作為底物，經(jīng)酶作用游離出萘酚或其衍生物，與重氮鹽作用形成偶氮色素，顯色于酶活性部位。（2）孵育液的配制：

萘酚AS-BI磷酸鹽5mg（底物）

溶于二甲基甲酰胺液0.25ml（促溶劑）

10％氯化鎂2滴（激活劑）

蒸餾水25ml

0.2mol醋酸鹽緩沖液（pH5.2～5.6）

25ml（緩沖液）

紅紫羅蘭IB鹽30mg（捕獲劑）

（或其他重氮鹽）

以上充分攪拌、溶解、過濾后使用。（3）操作步驟：

①新鮮組織，甲醛鈣固定10min

②冰凍切片或石蠟切片

③蒸餾水洗1～2min

④入孵育液，37℃10～60min（有色沉淀形成）

⑤雙蒸餾水漂洗2～3min

⑥l％甲基綠1～2min（復(fù)染細胞核）⑦蒸餾水漂洗1～2min

⑧甘油明膠封固。（脂溶性沉淀）（4）結(jié)果與評價：紅色顆粒為酶活性部位。

（5）對照：采用去底物實驗。3.電鏡顯示法

（1）預(yù)處理：

①固定：2％戊二醛（0.1mol/L二甲胂酸鹽緩沖液，8％蔗糖，pH7.2～7.4）固定60min；

②切片：冰凍切片機切片或振動切片機切片40～50um。（2）孵育液的配制：

醋酸鹽緩沖液0.1mol／L（緩沖液）

對硝基酚磷酸鈉3.0mmol／L（底物）

硝酸鉛3.6mmol／L（捕獲劑）（3）方法與步驟：

①新鮮組織，預(yù)固定并作冰凍切片40um；

②入孵育液，37℃，10～20nim（磷酸鉛沉淀形成）

③冷1％四氧化鋨液后固定；

④95％乙醇脫水；

⑤環(huán)氧樹脂包理；超薄切片；電子染色；

⑥電子顯微鏡觀察。（4）結(jié)果與評價：陽性沉集物為高電子密度顆粒。

（5）對照：去底物對照，抑制劑對照，硝基酚磷酸鈉。

5.酸性磷酸酶的生物學(xué)意義

酸性磷酸酶廣泛分布于生物體內(nèi)，一般認為酸性磷酸酶位于溶酶體，是溶酶體的標志酶。三、三磷酸腺苷酶

ATP酶為水解ATP產(chǎn)生ADP和磷酸的酶。ATP酶種類繁多，重要的ATP酶有：

（1）細胞膜ATP酶Na+、K+-ATP酶和Ca2+、Mg2+-ATP酶。

（2）肌球蛋白ATP酶因它可被Ca2+激活，故又稱為Ca2+-ATP酶。

（3）線粒體ATP酶Mg2+-ATP酶可被Mg2+所激活。

（4）溶酶體膜ATP酶H+、K+-ATP酶。硝酸鉛法顯示Mg2+激活的三磷酸腺苷酶（Mg2+-ATPase）

（1）原理：ATPase水解磷酸之間的高能鍵，釋放大量能量，而不能水解磷酸與碳之間的鍵。釋放出來的磷酸離子被鉛離子捕獲，經(jīng)硫化銨處理形成硫化鉛沉淀顯色。（2）孵育液的配制：

三磷酸腺苷二鈉10mg（底物）

0.2mol/LTris-HCl（pH7.2）

10ml（緩沖液）

0.1mol/LMgSO42.5ml（激活劑）

2％Pb(NO3)21.5ml（捕獲劑）

蔗糖1.8g（和緩劑）

雙蒸餾水加至25ml

配制時Pb(NO3)2要逐滴加入，并隨時攪拌，使充分混合至無色透明或過濾后使用。（3）操作步驟：

1）新鮮組織，冰凍切片；

2）冷10％福爾馬林固定10～20min

3）蒸餾水沖洗2～3min

4）入孵育液，37℃，孵育10～60min

（磷酸鉛沉淀形成）

5）蒸餾水洗2～3min

6）入1％硫化銨1min（硫化鉛沉淀形成）

7）蒸餾水洗；

8）甘油明膠封固。（非脂溶劑穩(wěn)定沉淀）（4）結(jié)果與評價：酶活性處呈棕黑色硫化鉛沉淀。電鏡下陽性沉集物為高電子密度顆粒。（5）對照：

①除去底物，則反應(yīng)為陰性；

②以β-甘油磷酸鈉代替底物，顯示染色反應(yīng)為堿性磷酸酶的定位。四、非特異性酯酶

1．反應(yīng)原理

（1）偶氮色素法在酶的作用下，從底物游離出來的α-萘酚（或β-萘酚、萘酚AS衍生物）與重氮鹽偶聯(lián)形成偶氮色素，同時沉著于酶的存在部位，通過偶氮色素的顯色，可以證明酶的存在部位。（2）嗜鋨性硫酯法在酶作用下，底物硫酯被水解后，游離出的硫酚（含-SH）立即與堅牢藍BBN相偶聯(lián)，形成嗜鋨酸性偶氮硫醚。經(jīng)鋨處理偶氮硫醚即形成電子密度高的鋨黑。S-乙?；?2-巰基苯酰替苯胺（TAB）（3）硫代乙酸法在酶的作用下，底物硫代乙酸游離出的硫化氫與鉛反應(yīng)成為硫化鉛而沉著。此法的原理也應(yīng)用于電鏡證明法。反應(yīng)原理如下：

酯酶Pb(NO3)2

CH3COSH—→CH3COOH+H2S—→PbS↓2．α-萘基乙酸酯法

1）孵育液的配制：

α-萘基乙酸酯10mg（底物）

丙酮0.25ml（促溶劑）

0.1mol／L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）

20ml（緩沖液）

堅牢藍B鹽50～100mg（捕獲劑）

攪拌過濾使用。2）操作步驟：

①新鮮組織恒冷箱切片，福爾馬林固定；

②入孵育液，室溫或37℃10～20min

（有色沉淀形成）

③流水洗3～5min

④Mayer蘇木精染色4～6min（核復(fù)染）

⑤流水沖洗5～6min

⑥甘油明膠封固。（脂溶性沉淀）3）結(jié)果與評價：酶活性部位呈黑色，胞核呈暗褐色。4.非特異性酯前的生物學(xué)意義非特異性酯酶主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體，也可能有少量存在于線粒體和胞液內(nèi)。因此，光鏡下整個細胞質(zhì)顯示了酶活性的染色反應(yīng)。非特異性酯酶生理功能尚不清楚，目前認為主要參與酯類物質(zhì)代謝，也與蛋白質(zhì)代謝活動有關(guān)系。

適用于：睪丸，卵巢，腎上腺，巨噬細胞等的研究。五、碳酸酐酶

1．反應(yīng)原理

目前，組織化學(xué)中顯示碳酸酐酶的方法有三種：

1）用同位素標記的抑制劑與酶相結(jié)合的放射自顯影術(shù)；

2）應(yīng)用抗體的免疫組織化學(xué)法；

3）酶反應(yīng)物的金屬鹽沉淀法?，F(xiàn)在最常用的是金屬鹽反應(yīng)法。2．光鏡顯示法

（1）孵育液的配制：

溶液Ⅰ：

0.1mol／LCoSO40.5～5ml（捕獲劑）

0.5mol／LH2SO43ml（中和劑）

0.067mol／LKH2PO40.5ml（緩沖液）

蒸餾水加至總量8.5ml溶液Ⅱ：

NaHCO3380mg（底物）溶于雙蒸餾水20ml中（使用前新鮮配制）臨用前將溶液Ⅰ與溶液Ⅱ混合，攪拌4min，再靜置4min，然后移至玻璃培養(yǎng)皿中待用。注意攪拌時間需一致，以保反應(yīng)結(jié)果穩(wěn)定。（2）步驟：

①取材：新鮮冰凍切片；

②固定：可用多聚甲醛或戊二醛，如：

1％～2％戊二醛二甲胂酸鈉緩沖液中固定1～2h再分別以8％、10％、24％蔗糖溶液泡過夜，然后洗凈（未經(jīng)固定的組織，其CAH活力可減低5％～10％）；③切片：新鮮組織或經(jīng)固定的組織塊用恒冷切片機切片，10～20um

④孵育：孵液中漂浮，室溫下4～12min

（無色氫氧化鈷沉淀形成）

⑤洗滌：蒸餾水洗，再以0.01molNa2HPO3或K2HPO3洗1～3min

⑥2％硫化銨1～2min（有色沉淀形成）⑦洗滌：先用蒸餾水，再用0.01mol／LpH4.3的醋酸水溶液輕洗切片；

⑧甘油明膠封片，光鏡鏡檢。（非脂溶劑穩(wěn)定沉淀）4.生物學(xué)意義碳酸酐酶是催化CO2水合反應(yīng)和碳酸脫水反應(yīng)的酶。此酶多見于胃腺的壁細胞、主細胞、腎小管（近曲小管基底部和管腔面刷狀緣、遠曲小管基底部）、集合小管、小腸吸收上皮、紅細胞、破骨細胞中，在哺乳動物的神經(jīng)膠質(zhì)細胞中，該酶與神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)有關(guān)。六、過氧化物酶

1.反應(yīng)原理

過氧化物酶催化的反應(yīng)中有兩種底物，即受氫體和供氫體。前者的代表為過氧化氫，后者的代表為聯(lián)苯胺系列的試劑，其反應(yīng)的通式如下：

AH2＋H2O2―――→HA＋2H2O

供氫體供氫體的氧化物當最后形成供氫體的氧化物時，一些供氫體的氧化物會呈色，主要是外源性供氫體，如DAB、TMB。供氫體因氧化而顯色。目前多采用聯(lián)苯胺系列的試劑作為供氫體，如DAB、TMB等。2．顯示方法

（1）孵育液的配制：

孵育液Ⅰ：

DAB·4HCl10mg（底物＋顯色劑）

溶于蒸餾水5ml

0.2mol／L磷酸緩沖液（pH6.5～7.0）5ml

l％H2O20.1ml（底物）

此種孵育液特別適于組織過氧化物酶的顯示孵育液Ⅱ：

DAB·4HCl5mg（底物＋顯色劑）

0.05mol／LTris-HCl（pH7.6）

10ml

1％H2O20.1ml（底物）

此種孵育液特別適于辣根過氧化物酶的顯示（2）步驟：

1）固定：4℃下，30min（3％戊二醛固定液：20％戊二醛15ml或25％戊二醛12ml，0.2mol／L磷酸緩沖液或二甲胂酸緩沖液50ml，蒸餾水加至100ml）。

2）浸洗：用固定液中使用的緩沖液浸洗三次以上，每次15min，或浸洗過夜；3）冰凍切片，厚度為5～10um；

4）預(yù)孵育：室溫下10～30min；

5）孵育液，室溫，5～60min；

6）蒸餾水漂洗，亞甲藍染核；

7）甘油明膠封片。2.結(jié)果與評價：一般DAB法酶活性陽性部位呈棕褐色，TMB法反應(yīng)呈深藍色。

3.對照：去H2O2。4.生物學(xué)意義過氧化物酶是一種氧化還原酶。與過氧化氫酶、細胞色素氧化酶有相似的化學(xué)本質(zhì)，即都屬于血紅素類蛋白質(zhì)，它們都有相同的輔基，即鐵卟啉。過氧化物酶和過氧化氫酶的催化機制是相似的，都可使過氧化氫分解，且兩者都存在于過氧化物酶體之中。

但兩者也有差別：

過氧化氫酶：催化H2O2，生成水，并釋放出O2，實際上是一種氧化還原反應(yīng)，供氫體和受氫體都是過氧化氫。即一分子H2O2被氛化成O2，而另一分子H2O2則被還原成水：

過氧化氫酶

H2O2+H2O2――――→2H2O+2O2

過氧化物酶：H2O2還