第3單元 免疫凝集類實(shí)驗(yàn)

第三單元免疫凝集類實(shí)驗(yàn)

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)一直接凝集實(shí)驗(yàn)顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接反應(yīng)，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下出現(xiàn)的肉眼可見的凝集現(xiàn)象。常用的試驗(yàn)方法有玻片凝集法和試管凝集法。本實(shí)驗(yàn)以試管法凝集試驗(yàn)——肥大試驗(yàn)（Widaltest）驗(yàn)證凝集反應(yīng)及其特點(diǎn)。

Widaltest原理

將已知的顆粒性抗原（傷寒沙門菌）定量加入到系列倍比稀釋的待測(cè)血清中，根據(jù)各血清稀釋度凝集情況，測(cè)定血清中有無(wú)相應(yīng)抗體及其相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)器材和材料器械

試管、吸管、恒溫水浴箱等試劑

抗體待測(cè)傷寒沙門菌免疫血清、抗原傷寒沙門菌診斷菌液（7×108/ml)、生理鹽水實(shí)驗(yàn)方法（Widaltest）

取試管7支，依次編號(hào)并做好標(biāo)記。每支試管中加生理鹽水0.5ml。倍比稀釋血清：

取1∶20稀釋的待測(cè)血清0.5ml加入到第1管，混勻后吸取0.5ml加入到第2管，如此連續(xù)稀釋至第6管，混勻后吸取0.5ml棄去；第7管不加血清作為陰性對(duì)照。

加診斷菌液：

每管加傷寒沙門菌H或O診斷菌液0.5ml，此時(shí)各管血清最終稀釋度依次為1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560搖勻后置37℃水浴2～4h，取出觀察結(jié)果或放室溫過夜，次日觀察結(jié)果。試管凝集法操作程序試管號(hào)1234567生理鹽水（ml)0.50.50.50.50.50.50.5待測(cè)血清（ml)0.50.50.50.50.50.5傷寒O菌液(ml)0.50.50.50.50.50.50.5血清稀釋度1:801:1601:3201:6401:12801:25600.50.50.50.50.5棄掉0.5結(jié)果

1234567菌液試管凝集試驗(yàn)原理

結(jié)果判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將試管置于有良好光源和黑色背景下，觀察管底凝集物的范圍和上清液的濁度，記錄凝集程度，判斷凝集效價(jià)用++++、+++、++、+、-等符號(hào)記錄凝集效價(jià)。對(duì)照管：應(yīng)無(wú)凝集現(xiàn)象試驗(yàn)管：“++++”：上清液澄清，細(xì)菌全部凝集，凝集塊全部沉于管底

“+++”：上清液稍混濁，細(xì)菌大部分凝集并沉于管底

“++”：上清液較混濁，約50%的細(xì)菌凝集并沉于管底

“+”：上清液混濁，僅少量細(xì)菌凝集

“-”：不凝集，液體濁度與對(duì)照管相同血清抗體效價(jià)：試驗(yàn)管出現(xiàn)“++”以上的凝集現(xiàn)象即可判斷為陽(yáng)性；以出現(xiàn)“++”凝集的最高血清稀釋度為該待測(cè)血清的抗體效價(jià)。注意事項(xiàng)凝集反應(yīng)只有在抗原抗體比例適當(dāng)時(shí)，才能出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)一般情況下，隨著血清濃度的逐漸稀釋，凝集反應(yīng)越來(lái)越弱，但在抗體濃度過高時(shí)，反而無(wú)凝集現(xiàn)象出現(xiàn)，此為前帶現(xiàn)象，出現(xiàn)該情況時(shí)，須加大抗體稀釋倍數(shù)重新試驗(yàn)。直接凝集試驗(yàn)也可以用玻片法以鑒定傷寒沙門菌為例：取潔凈載玻片2張，在玻片的左上角分別標(biāo)明“1”、“2”；加入已知抗體（傷寒沙門菌診斷血清）和待測(cè)菌液（傷寒沙門菌或其他細(xì)菌）。1生理鹽水

+傷寒桿菌

1:40傷寒桿菌診斷學(xué)清

+

傷寒桿菌2生理鹽水

+大腸桿菌

1:40傷寒桿菌診斷學(xué)清

+

大腸桿菌玻片凝集試驗(yàn)鑒定傷寒沙門菌

玻片凝集試驗(yàn)(slideagglutinationtest)顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合

出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象

在玻片上YYY+

？Y+

將載玻片置黑色背景上觀察。在診斷血清中，混懸液由混濁變澄清并出凝集物，則為陽(yáng)性結(jié)果；混懸液仍為勻混濁的乳狀液，則為陰性結(jié)果。肉眼觀察不夠清晰者，可在低倍鏡下觀察。

結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)討論肥大試驗(yàn)是一種經(jīng)典的半定量試管凝集試驗(yàn)。在臨床上主要用已知的傷寒沙門菌O或H抗原檢測(cè)血清中有無(wú)相應(yīng)的特異性抗體及其效價(jià)，以協(xié)助診斷傷寒病或供流行病學(xué)調(diào)查。凝集反應(yīng)只有在抗原抗體比例適當(dāng)時(shí)，才能出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。臨床上開展的外斐反應(yīng)是利用與立克次體有共同耐熱性多糖抗原的變形桿菌OX19、OX2、OXk菌株代替立克次體作為已知抗原，與患者血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)，以輔助診斷斑疹傷寒、恙蟲病等立克次體疾病?，F(xiàn)有OX19、OX2、OXk三種診斷菌液和待測(cè)血清，請(qǐng)寫出利用試管凝集法進(jìn)行的外斐試驗(yàn)的操作步驟。思考題為什么臨床上不直接利用立克次體作為已知抗原進(jìn)行血清學(xué)診斷呢？

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)二間接凝集實(shí)驗(yàn)

間接凝集實(shí)驗(yàn)（indirectAgglutinationTest)

將可溶性抗原（或抗體）先吸附于一種與免疫無(wú)關(guān)、大小均勻的惰性載體顆粒表面，使其成為致敏載體，然后再與相應(yīng)抗體（或抗原）結(jié)合，在適當(dāng)電解質(zhì)存在的條件下，載體顆粒被動(dòng)地發(fā)生凝集，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。

以膠乳凝集試驗(yàn)檢測(cè)類風(fēng)濕因子（rheumatoidfactor,RF）為例驗(yàn)證間接凝集實(shí)驗(yàn)的原理和特點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)原理

類風(fēng)濕因子（RF）是一種抗變性IgG的自身抗體，具有與人或動(dòng)物變性IgG結(jié)合的特點(diǎn)。將處理過的人IgG與聚苯乙烯膠乳顆粒結(jié)合成致敏顆粒，當(dāng)待測(cè)血清中含有RF時(shí)，則與致敏顆粒上變性的IgG發(fā)生反應(yīng)，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。膠乳顆粒人IgG致敏致敏膠乳NS凝集顆粒待測(cè)RF實(shí)驗(yàn)器材

器械 黑色方格反應(yīng)板、毛細(xì)滴管、試管、試管架、吸耳球、恒溫水浴箱等試劑 人IgG致敏膠乳試劑（市售類風(fēng)濕因子檢測(cè)試劑） 類風(fēng)濕因子陽(yáng)性血清和陰性血清：臨床標(biāo)本篩選獲得

待測(cè)血清

實(shí)驗(yàn)方法

待測(cè)血清、陽(yáng)性血清、陰性血清分別用生理鹽水作1∶20稀釋。在黑色方格反應(yīng)板上取3個(gè)格，用毛細(xì)滴管分別滴加稀釋待測(cè)血清、陽(yáng)性血清、陰性血清各1滴，然后每格加入人IgG致敏膠乳試劑1滴。連續(xù)輕輕搖動(dòng)反應(yīng)板，2～3分鐘后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷

若膠乳顆粒凝集且液體澄清者為陽(yáng)性反應(yīng)膠乳顆粒不凝集仍保持均勻膠乳狀者為陰性反應(yīng)注意事項(xiàng)試劑應(yīng)4℃保存，嚴(yán)禁凍結(jié)，用時(shí)搖勻；所有試驗(yàn)器皿和反應(yīng)板均應(yīng)洗凈、干燥；若陰性對(duì)照出現(xiàn)凝集，則表示致敏乳膠試劑有質(zhì)量問題，不能使用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析和討論膠乳凝集試驗(yàn)方法簡(jiǎn)便、快速，但易發(fā)生非特異性凝集反應(yīng)，試分析如何判定實(shí)驗(yàn)的非特異性凝集反應(yīng)。判斷凝集或凝集程度除目測(cè)外，是否還有其他方法？驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)三間接凝集抑制實(shí)驗(yàn)概念間接凝集抑制試驗(yàn)（indirectagglutinationinhibitiontest）是以抗原致敏的載體及相應(yīng)抗體作為診斷試劑，用于檢測(cè)標(biāo)本中是否含有與致敏抗原相同的抗原的試驗(yàn)。檢測(cè)時(shí)先將抗體試劑與待測(cè)標(biāo)本混合，再加入抗原致敏的載體。若標(biāo)本中沒有與抗體試劑相對(duì)應(yīng)的抗原，則抗體試劑與隨后加入的致敏載體上的抗原結(jié)合而出現(xiàn)凝集；若標(biāo)本中存在與抗體試劑相對(duì)應(yīng)的抗原，抗體先與之結(jié)合，隨后加入的致敏載體上的抗原則無(wú)抗體結(jié)合，凝集反應(yīng)被抑制。本實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)尿絨毛膜促性腺激素（HCG）的妊娠免疫診斷試驗(yàn)為例進(jìn)行膠乳凝集抑制現(xiàn)象的觀察和驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)原理

孕婦尿液中含有HCG，正常人尿中無(wú)HCG。當(dāng)向孕婦尿中加入一定量抗HCG抗體時(shí)，尿HCG即與抗HCG發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，此時(shí)，再加入膠乳抗原（吸附有HCG的聚苯乙烯膠乳顆粒），因抗體被消耗，故不能發(fā)生凝集，即凝集被抑制，為凝集抑制試驗(yàn)陽(yáng)性；反之，若待檢尿中無(wú)HCG（非妊娠尿），則加入的抗HCG抗體未被結(jié)合和消耗，可與隨后加入的乳膠抗原發(fā)生反應(yīng)，出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)小顆粒，即凝集未被抑制，為凝集抑制試驗(yàn)陰性。待測(cè)尿液(含HCG)抗HCG特異結(jié)合抗原抗體復(fù)合物NS＋致敏膠乳無(wú)凝集顆粒為陽(yáng)性待測(cè)尿液(無(wú)HCG)抗HCG無(wú)結(jié)合NS＋致敏膠乳有凝集顆粒為陰性實(shí)驗(yàn)器材和材料器械 黑色方格反應(yīng)板、毛細(xì)滴管試劑與標(biāo)本膠乳抗原（HCG致敏的膠乳顆粒）、抗HCG抗體（商品化）孕婦尿液、正常人尿液、待測(cè)尿液。生理鹽水實(shí)驗(yàn)方法在黑色方格反應(yīng)板上取3個(gè)格，用毛細(xì)滴管分別加待測(cè)尿液、孕婦尿液、正常人尿液（或生理鹽水）1滴，然后每格加抗HCG抗體1滴，輕輕搖動(dòng)1～2min。于上述3格中各滴加膠乳抗原1滴，輕輕搖動(dòng)2～3min后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷如肉眼觀察結(jié)果不清楚，可用顯微鏡在低倍鏡下觀察樣本待測(cè)尿液孕婦尿液正常人尿(或NS)現(xiàn)象凝集或不凝集不凝集凝集結(jié)果判定非妊娠尿或妊娠尿陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照

注意事項(xiàng)待測(cè)尿液宜采用晨尿，不能及時(shí)檢測(cè)檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)保存于2~8℃，不能使用嚴(yán)重蛋白尿、血尿、菌尿標(biāo)本；試劑應(yīng)4℃保存，切勿凍存。使用前使試劑接近室溫并搖勻；應(yīng)同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照，以排除非特異性凝集；所加液滴應(yīng)大小一致；結(jié)果應(yīng)在強(qiáng)光下觀察，觀察時(shí)應(yīng)置黑色背景下或稍傾斜反應(yīng)板。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析和討論妊娠免疫診斷試驗(yàn)是臨床常用的經(jīng)典膠乳凝集抑制試驗(yàn)，操作簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)，停經(jīng)35～40天以上的孕婦可測(cè)得陽(yáng)性結(jié)果。需注意的是，絨毛膜上皮癌、葡萄胎及睪丸畸胎瘤病人尿中HCG含量遠(yuǎn)較正常妊娠尿液為高，將尿液作1∶200稀釋后仍可呈陽(yáng)性反應(yīng)。待測(cè)尿液以晨尿?yàn)楹谩y(cè)試時(shí)應(yīng)注意標(biāo)本及各診斷試劑加入的順序，并設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照。試分析若隨意變更加樣順序，如先加標(biāo)本、再加膠乳抗原，最后加抗HCG或先加膠乳抗原、再加抗HCG，最后加標(biāo)本，結(jié)果如何？

凝集抑制試驗(yàn)可用于確證呈陽(yáng)性反應(yīng)的間接凝集實(shí)驗(yàn)是否是非特異凝集反應(yīng)，試討論如何進(jìn)行該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)？

不完全抗體檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)）

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

采用紅細(xì)胞作為凝集試驗(yàn)的抗原，創(chuàng)造條件設(shè)法使相鄰的紅細(xì)胞靠近、聚攏、凝集從而達(dá)到對(duì)紅細(xì)胞不完全抗體的檢測(cè)目的。問題背景資料

抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合后，在適宜的介質(zhì)參與下可出現(xiàn)可見的抗原抗體反應(yīng)。但有些分子較小的7S的IgG類抗體，體積小，長(zhǎng)度短，在適宜介質(zhì)中與相應(yīng)抗原結(jié)合后不出現(xiàn)可見反應(yīng)，這種抗體稱為不