細胞生物學3.細胞生物學研究方法

TechniquesinCellBiology細胞生物學研究方法光學顯微鏡技術（lightMicroscopy）電子顯微鏡技術(Electromicroscopy)掃描探針顯微鏡（ScanningProbeMicroscope）第一節(jié)細胞形態(tài)結構的觀察方法一光學顯微鏡技術（lighticroscopy）復合顯微鏡：現今使用的光學顯微鏡都是由幾個透鏡組合而成，所以又稱為復合顯微鏡。構成：（1）光學放大系統:（2）照明系統：（3）機械和支架系統原理：經物鏡形成倒立實像，經目鏡進一步放大成像。

顯微鏡適合的放大倍數放大倍數：是眼睛看到像的大小與對應標本長度大小的比值。放大倍數＝目鏡的放大倍數X物鏡的放大倍數人眼的分辨能力在0.1mm左右

①固定：可使生物大分子交聯，蛋白質成分凝固，防止細胞自溶和破壞而產生人工假象。常用固定劑：甲醛、戊二醛、乙醇②包埋：便于切片，防止樣品移位,常用包埋劑：石蠟③切片：生物樣品太厚，不能直接用光鏡觀察，需切成1～10μm的薄片

④染色:

蘇木精－對負電荷分子有親和力，可顯示細胞內核酸的分布伊紅－可使細胞質染色

2、光學顯微鏡的樣品制備與觀察蘇木精-伊紅染色，又稱“蘇木素-伊紅染色”，或“H&E染色”（hematoxylinandeosinstain、HEstain），是組織學最常用的染色方法之一。這種染色方法的基礎是組織結構對不同染料的結合程度不同。染料蘇木精可以將嗜堿性結構染成藍紫色，而伊紅可以將嗜酸性結構染成粉紅色。嗜堿性結構通常包括含有核酸的部分，如核糖體、細胞核及細胞質中富含核糖核酸（RNA）的區(qū)域等。嗜酸性結構則通常由細胞內及細胞間的蛋白質，如路易體（Lewybody）、酒精小體（Mallorybody）、細胞質的大部分等。正置顯微鏡倒置顯微鏡（二）熒光顯微鏡FLUORESCENCEMICROSCOPE概念：是以紫外線為光源激發(fā)生物樣品中的熒光物質，產生能觀察到的各種顏色熒光的一種光學顯微鏡。特點：光源為紫外線，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡；自發(fā)熒光:由細胞本身存在的物質經紫外線照射所發(fā)出的熒光。誘發(fā)熒光:一些細胞成分本身經紫外線照射后不發(fā)熒光，但用熒光染料（酸性品紅、甲基綠、吖叮橙等熒光色素）進行活體染色或固定后切片染色，就能在熒光鏡下看見熒光，這種熒光叫誘發(fā)熒光。什么是熒光？當一個物體吸收了紫外光（短波光）的能量，物質中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出比原來吸收的波長更長的光為“熒光”。即：物質吸收短波光，發(fā)射出的長波光。染色

不染色

激發(fā)光發(fā)射光

熒光顯微鏡的種類

透射式

落射式熒光顯微鏡的在生命科學中的應用：

熒光顯微鏡技術包括免疫熒光技術和熒光素直接標記技術。熒光顯微鏡是目前在光鏡水平對特異蛋白質等生物大分子定性定位的最有力的工具。

蠑螈肺細胞的有絲分裂(240x),熒光。/AlexeyKhodjakov,紐約健康部門Wadsworth中心。（三）激光共聚焦掃描顯微鏡

是在熒光顯微鏡成像的基礎上裝有激光掃描裝置，以單色激光作為光源，使樣品被激發(fā)出熒光，利用計算機進行圖像處理，從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖像的一種光學顯微鏡。WHATISCONFOCALMICROSCOPY

Theresolutionofimagesobtainedwithconventionalmicroscopyareseriouslydeterioratedbythe"contamination"oftheimageplanewithout-of-focuslightWIDEFIELDCONFOCAL共聚焦掃描顯微鏡的成像基本原理分辨率可以比普通熒光顯微鏡的分辨率提高1.4～1.7倍由于點對點掃描去除了雜散光的影響conventionalconfocal可獲取連續(xù)光學切片優(yōu)點：多個（四個）熒光通道，可同時探測多個被標記物LCSMImageofaXenopusMelanophore

microtubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)2008年的諾貝爾化學獎授予了從事有關“綠色熒光蛋白質的發(fā)現,表達和發(fā)展”并取得重要成就的三位科學家:下村修、馬丁·查爾菲和錢永健。綠色熒光蛋白改造的蜜蜂（四）相差顯微鏡

相差顯微鏡（PHASECONTRASTMICROSCOPE）是一種將光線通過透明標本細節(jié)時所產生的光程差（即相位差）轉化為光強差的特種顯微鏡。把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。用途：觀察未經染色的玻片標本相差顯微鏡觀察的活細胞（五）微分干涉差顯微鏡在相差顯微鏡原理的基礎上發(fā)明其優(yōu)點是能顯示結構的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，其標本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強。。DIC顯微鏡下的硅藻（偽彩色）

微分干涉差顯微鏡的應用：

(Differential-interferencemicroscope)DIC顯微鏡使細胞的細微結構立體感特別強，適合于顯微操作。目前像基因注入、核移植等生物工程的顯微操作常在這種顯微鏡下進行。微分干涉顯微鏡還可用于研究活細胞中較大的細胞器。將微分干涉顯微鏡接上錄像機，可以觀察活細胞中的顆粒及細胞器的運動。二、電子顯微鏡

一、分類：透射電子顯微電鏡（TransmissionelectronMicroscopeTEM）掃描電子顯微電鏡（ScanningelectronMicroscopeSEM）掃描隧道顯微鏡各種光及電子束的波長透射電子顯微電鏡1、電子顯微鏡與光學顯微鏡的基本區(qū)別

顯微鏡分辨本領光源透鏡真空成像原理光鏡電鏡200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束(0.01-0.9)玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差2、電子顯微鏡的分辨本領與有效放大倍數

電子顯微鏡的分辨率可達0.2nm，其放大倍數為100萬倍。上述放大倍數稱之為有效放大倍數；如繼續(xù)通過光學手段放大也不會得到任何有意義的信息，因此稱之為“空放大”。電鏡的分辨本領:

是指電鏡處于最佳狀態(tài)下的分辨率。實際情況下，電鏡的實際分辨率常常受到生物制樣技術本身的限制，如在超薄切片樣品中其分辨率約為超薄切片厚度的1/10，即通常切片厚度若是50nm，其實際分辨率約為5nm，遠低于電鏡的分辨本領0.2nm。

由于電子束穿透力很弱，因此用于電鏡觀察的標本須制成厚度僅20－50nm

的超薄切片，并放在銅網上。這種切片需要用超薄切片機制作。1.

超薄切片技術二、主要電鏡制樣技術：超薄切片銅網取材:要快，避免損傷，標本必須薄，小固定:常用戊二醛和四氧化鋨固定，四氧化鋨除與蛋白共價結合外,還對脂類有良好的固定效果。脫水:等級梯度脫水，用脫水有利包埋。包埋:為制成超薄切片,并使切片耐受高真空、電子轟擊,切片前需包埋,常用環(huán)氧樹脂。切片:將樣品制成50～100nm厚的薄片。染色:生物分子由原子序數低的輕元素組成,散射電子能力弱,無明暗反差,需進行染色。常用的染色劑：醋酸鈾、枸櫞酸鉛。透射電鏡標本制備過程:

觀察組織、細胞內部超微結構。分辨率0.2nm。標本在熒光屏上呈黑白反差的結構影像。電子密度高、電子密度低：被重金屬浸染呈黑色的結構，稱電子密度高；反之，淺染的部分稱電子密度用重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對鋪展在載網上的樣品進行染色；吸去染料，樣品干燥后，樣品凹陷處和樣品周圍鋪了一薄層重金屬鹽，而凸出處則沒有染料沉積，從而出現負染效果，分辨力可達1.5NM左右。示肌動蛋白纖維

二負染色（negativestaining）技術亦稱冰凍斷裂(freeze-fracture)，是研究生物膜內部結構的一種有用的技術，關于膜結構的許多資料即是利用這種方法取得的。冰凍斷裂技術也是研究細胞內部各種細胞器結構的有用手段。三冰凍蝕刻技術①將標本于-100℃干冰中或-196℃液氮中，超低溫冰凍。

冰凍蝕刻技術的操作步驟:②然后用冷刀驟然將標本沖斷開，升溫后冰在真空條件下迅即升華，細胞內外凡含水多的地方因失水而下陷,暴露出了斷裂面的膜和其它一些結構,增強了斷面的浮雕效果－蝕刻。③標本蝕刻后，再向斷裂上以45°噴金,90°噴碳后將樣品浸泡于腐蝕液中將生物組織腐蝕掉，只剩下鉑－碳復型膜。④復膜顯示出了標本蝕刻面的形態(tài)，撈于載網上干燥后可置于透射電鏡下觀察。電鏡下的影像即代表標本中細胞斷裂面處的結構。復膜

細胞冰凍斷裂后的電鏡圖像（二）掃描電子顯微鏡20世紀60年代問世，用來觀察標本表面結構。分辨力為6~10NM，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個光點的能力）為0.2MM，掃描電鏡的有效放大倍率為20000X。掃描電子顯微鏡原理工作原理：

是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結構有關，次級電子由探測器收集，信號經放大用來調制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。掃描電子顯微鏡生物樣品制備的基本操作程序掃描電鏡照片展示不同倍率的果蠅掃描電鏡照片掃描電鏡照片展示可以用計算機將黑白照片處理成彩色掃描電鏡照片展示人類精子（三）掃描隧道顯微鏡SCANNINGTUNNELINGMICROSCOPE，

分辨率：X-Y向0.1nm（原子級分辨率）掃描隧道顯微鏡是用來顯示物質表面原子排布的一種顯微鏡，它是根據量子力學中的隧道效應而設計的。

掃描隧道顯微鏡原理示意圖

探針和物體之間加上電壓。如果探針距離物體表面很近——大約在納米級的距離上電子會穿過物體與探針之間的空隙，形成一股微弱的電流。如果探針與物體的距離發(fā)生變化，這股電流也會相應的改變。這樣，通過測量電流我們就能知道物體表面的形狀，1、原子級高分辨率。如STM在平行和垂直于樣品表面方向的分辨率分別可達0.1nm和0.01nm，即可以分辨出單個原子，具有原子級的分辨率。

2、可在真空、大氣、常溫等不同環(huán)境下工作，甚至可將樣品浸在水和其它溶液中，不需要特別的制樣技術，并且探測過程對樣品無損傷。這些特點適用于研究觀察生物大分子(如DNA、RNA和蛋白質等)的原子布陣和一些生物結構(如生物膜、細胞壁等)的原子排列,而不需要特別的制樣技術，并且探測過程對樣品無損傷——納米科學水平。掃描隧道顯微鏡的優(yōu)越之處：第二節(jié)細胞組分的分析方法

一、用超離心技術分離細胞器與生物大分子及其b

復合物二、細胞內核酸、蛋白質、酶、糖與脂類等的顯b

示方法三、特異蛋白抗原的定位與定性四、細胞內特異核酸的定位與定性一、用超離心技術分離細胞器與生物大分子及其合物各種離心技術——離心是研究亞細胞成分和生物大分子的基本手段。1924年svdberg發(fā)明了世界上第一臺分析超速離心機。離心機：普通：8000rpm以下；高速：8000~25000rpm；超速：25000rpm以上，達十幾萬rpm。一般步驟：勻漿化離心處理收集分析（一）差速離心DIFFERENTIALCENTRIFUGATION主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細胞器。起始的離心速度較低，讓較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集沉淀，改用較高的離心速度離心懸浮液，將較小的顆粒沉降，以此類推，達到分離不同大小顆粒的目的。差速離心

低速離心

中速離心

高速離心

超高速離心

細胞勻漿細胞核仁細胞骨架大細胞器小細胞器核糖體大分子

2、等密度離心法：

按細胞組分的浮力密度不同進行分離的方法。適用于大小、形態(tài)相似而密度不同的組分。常將樣品通過高濃度的蔗糖或氯化銫的密度梯度沉降在達到與自身密度相等的位置就停滯不再向下沉降。常用介質：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。密度梯度離心分離溶酶體、線粒體和微體CsCl密度梯度離心分離DNA密度大于1.3g/cm3

原理：利用一些顯色劑與所檢測物質中一些特殊基團特異性結合的特征，通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質在細胞中的分布和含量。

利用這種方法對細胞的各種成分幾乎都能顯示，包括糖類、脂類、核酸、酶等。二、細胞內核酸、蛋白質、酶、糖與脂類等的顯示方法核酸顯示方法－－－－Feulgen反應Feulgen和Rossenbeck(1924)發(fā)明，對DNA的反應具有高度專一性。原理:

標本經稀鹽酸水解后，DNA分子中的嘌呤堿基被解離，從而在核糖的一端出現了醛基。Schiff試劑中的無色品紅與醛基反應，形成含有醌基的化合物，醌基為發(fā)色團，呈現出紫紅色。Feulgen反應糖類顯示方法－－－過碘酸雪夫反應（periodicacidSchiffreaction,PAS反應）基本原理：過碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇基變?yōu)橐叶┗?，后者繼而與Schiff試劑（無色亞硫酸品紅復合物）結合，形成紫紅色反應產物。酶組織化學染色法基本原理：

是利用酶對其相應底物的水解、氧化等作用，然后再使底物的反應產物與某種試劑發(fā)生反應，形成沉淀或有色的最終產物，借此檢測該酶在組織切片或細胞內的分布及活性強弱。Electronmicrographofacellshowingthelocationofaparticularenzyme(nucleotidediphosphatase)intheGolgiapparatus.Athinsectionofthecellwasincubatedwithasubstratethatformedanelectron-denseprecipitateuponreactionwiththeenzyme

脂類物質包括脂肪和類脂。標本用甲醛固定，冷凍切片，脂類保存較好。多用蘇丹染料、油紅O、尼羅藍等溶于脂類的染料染色，使脂質呈色。也可用四氧化鋨（OSO4）染色，脂肪酸或膽堿可使OSO4還原為OSO2而呈黑色。

2．脂類顯示方法

二十世紀70年代以來，免疫學的迅速發(fā)展為細胞生物學的研究提供了強有力的手段，特別是在細胞內特異蛋白的定位與定性方面，單克隆抗體與其它一些檢測手段相結合發(fā)揮了重要作用。免疫細胞化學技術與免疫電鏡是最常見的研究細胞內蛋白質分子定位的重要技術。三、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫細胞化學技術（Immunocytochemistry）利用抗原和抗體的結合具有高敏感性和特異性的特點，用已知的經過標記的抗體檢測組織與細胞中相應抗原的方法。常用的標記方法：1)熒光標記：異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明2)酶標記：辣根過氧化物酶（HRP）3)膠體金標記：即金的水溶液，具有一般溶液的特性，用它與抗體標記后，經抗原抗體反應可定位抗原的存在。免疫熒光技術就是將免疫學方法（抗原抗體特異結合）與熒光標記技術相結合用來研究特異蛋白抗原在細胞內分布的方法。常用的螢光素有異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明(rhodamine)等。實質就是用結合有熒光素的抗體與組織內抗原反應，在熒光顯微鏡下觀察抗原的存在部位。也可分為直接法和間接法。

它主要包括熒光抗體的制備，標本的處理，免疫染色和觀察記錄等過程。標本處理有多種方法，組織切片、冰凍切片都可應用，其宗旨只有一個，即要盡量完好地保持被檢測蛋白的抗原性；免疫染色就是抗原抗體反應的過程，這里要注意設立各種實驗對照以檢驗結果的可靠性。主要步驟：炭疽桿菌24h培養(yǎng)物直接熒光抗體檢測間接熒光抗體檢測細胞培養(yǎng)中的豬瘟病毒核酸雜交原理四、細胞內特異核酸的定位與定性

四、細胞內特異核酸的定位與定性

原位雜交(insituhybridization)：

在不破壞細胞或細胞器的情況下，用核酸探針檢測特定核苷酸序列在染色體上的精確位置的技術，稱為原位雜交(insituhybridization)。原位雜交技術首先是在光鏡水平上發(fā)展起來的，放射性同位素標記的探針與樣品中的DNA或RNA雜交后，用顯微放射自顯影的方法顯示雜交物的存在部位；或用熒光素標記的探針進行雜交，在熒光顯微鏡下直接顯示與探針雜交的核酸存在部位。原位雜交技術在顯微與亞顯微水平上研究基因定位、特異mRNA表達等問題的研究中起重要作用。熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH):FISH技術的原理圖解放射性同位素發(fā)射出的各種射線能使照相乳膠中的鹵化銀晶體還原(感光)。利用這樣的特性，用放射性化合物脈沖標記活細胞,經固定、切片后在暗處把感光乳膠覆蓋于切片上,在此期間,由于放射性同位素衰變使乳膠曝光,經顯影、定影,根據銀粒所在部位,就可知道細胞中放射性物質的分布。這種利用放射性物質使照相乳膠膜產生該物質自身影像的技術，稱為放射自顯影術。五、放射自顯影術

細胞培養(yǎng)

（一）動物細胞培養(yǎng)（二）植物細胞培養(yǎng)第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術

細胞培養(yǎng)

就是將動植物組織或細胞從機體取出，分散成單個細胞或直接以單細胞

生物，給予必要的生長條件，讓其在培養(yǎng)瓶中或培養(yǎng)基上繼續(xù)生長與增殖。

是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行培養(yǎng)。因此，較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，但實際上，通常把第一代至第十代以內的培養(yǎng)細胞統稱為原代細胞培養(yǎng)。原代培養(yǎng)（primaryculture）：

大都取自動物胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織

將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。

適應在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細胞稱為傳代細胞

傳代培養(yǎng)：

細胞株:通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得具有特殊性質或標志物的細胞稱為細胞株。如轉基因、基因敲除、被標記等。細胞株(CellStrain)

：

細胞系（CellLine）：原代培養(yǎng)物經首次傳代成功即成細胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細胞世系（LineageofCells）所組成。如果傳代培養(yǎng)不超過10左右，稱為有限細胞系（finitecellline）。如果細胞能連續(xù)傳代培養(yǎng)的，稱為連續(xù)細胞系（continuouscellline）。如果細胞能無限傳代培養(yǎng)，稱為永生化細胞系（immortalcellline）。細胞系（cellline）

:當培養(yǎng)細胞分裂增殖相互間密切接觸時，細胞停止活動的現象為接觸抑制。（非正常細胞如癌細胞除外）。接觸抑制和密度依賴性實驗室中常用的幾種細胞系細胞系名稱細胞類型來源3T3胚胎成纖維細胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細胞HenriettaLacksBHK21成纖維細胞敘利亞倉鼠PtKl上皮細胞袋鼠L6成肌細胞大鼠PCI2嗜鉻細胞大鼠