微生物實(shí)驗(yàn)室的分類及要求PPT幻燈片

一、微生物的生物安全等級(jí)根據(jù)生物因子對(duì)個(gè)體和群體的危害程度可將微生物分為4級(jí)1.危害等級(jí)I（低個(gè)體危害，低群體危害）這類微生物包括：不會(huì)導(dǎo)致健康工作者和動(dòng)物致病的細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等生物因子。2.危害等級(jí)Ⅱ(中等個(gè)體危害，有限群體危害)這類微生物能引起人或動(dòng)物發(fā)病，但一般情況下對(duì)健康工作者、群體、家畜或環(huán)境不會(huì)引起嚴(yán)重危害的病原體。實(shí)驗(yàn)室感染不導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，具備有效治療和預(yù)防措施，并且傳播風(fēng)險(xiǎn)有限。

3.危害等級(jí)III（高個(gè)體危害，低群體危害）這類微生物能引起人類或動(dòng)物嚴(yán)重疾病，或造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，但通常不能因偶然接觸而在個(gè)體間傳播，或能使用抗生素、抗寄生蟲藥治療的病原體。4.危害等級(jí)Ⅳ(高個(gè)體危害，高群體危害)能引起人類或動(dòng)物非常嚴(yán)重的疾病，一般不能治愈，容易直接或間接或因偶然接觸在人與人，或動(dòng)物與人，或人與動(dòng)物，或動(dòng)物與動(dòng)物間傳播的病原體。

二、生物危害評(píng)估

生物危害評(píng)估的內(nèi)容：危害程度評(píng)估應(yīng)至少包括下列內(nèi)容：A.生物因子的種類（已知的、未知的、基因修飾的或未知傳染性的生物材料）、B.來源C.傳染性D.致病性E.傳播途徑F.在環(huán)境中的穩(wěn)定性E.感染劑量F.濃度G.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)H.預(yù)防和治療。5.實(shí)驗(yàn)室門應(yīng)帶鎖并可自動(dòng)關(guān)閉。實(shí)驗(yàn)室的門應(yīng)有可視窗。6.實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有足夠的存儲(chǔ)空間擺放物品以方便使用。在實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域外還應(yīng)有供長(zhǎng)期使用的存儲(chǔ)空間。7.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)使用專門的工作服，應(yīng)戴乳膠手套。8.實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域外應(yīng)有存入個(gè)人衣物的條件。9.實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備高壓蒸汽滅菌器，并按期檢查和驗(yàn)證，以保證符合要求。10.應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)配備生物安全柜。11.應(yīng)設(shè)洗眼設(shè)施，必要時(shí)應(yīng)有應(yīng)急噴淋裝置。12.應(yīng)通風(fēng)，如使用窗戶自然通風(fēng)，應(yīng)有防蟲紗窗。13.有可靠的電力供應(yīng)和應(yīng)急照明，必要時(shí)，重要設(shè)備如培養(yǎng)箱、生物安全柜、冰箱等應(yīng)有備用電源。14.實(shí)驗(yàn)室出口應(yīng)有在黑暗中可明確辨認(rèn)的標(biāo)識(shí)。五、微生物實(shí)驗(yàn)室的建筑要求1.實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)應(yīng)以“無回路”為宗旨。2.在時(shí)間和空間上可有效隔離各種檢測(cè)活動(dòng)。3.實(shí)驗(yàn)室的區(qū)域設(shè)置上應(yīng)至少包括以下部分：a.樣品的接收和儲(chǔ)藏區(qū)；b.樣品的前處理區(qū)；c.樣品的微生物檢測(cè)區(qū)；d.培養(yǎng)區(qū)（BSL－2實(shí)驗(yàn)室可與檢測(cè)區(qū)合并）；e.標(biāo)準(zhǔn)菌株存放區(qū)（冰箱、低溫冰柜或常溫保存箱）；f.培養(yǎng)基與器材準(zhǔn)備區(qū)（也可與滅菌區(qū)合并）；g.無菌區(qū)；h.污染物處理區(qū)；i.辦公區(qū)；j.更衣室；4.建筑要求：a.墻壁、天花板、地面和桌椅、操作臺(tái)應(yīng)光滑易清潔。b.天花板應(yīng)設(shè)置為統(tǒng)一無隙整體，以減少灰塵下落c.地面、墻壁、天花板連接處應(yīng)有弧度。d.除非密閉包裝，液體運(yùn)輸管路不應(yīng)在工作區(qū)上方穿過。e.換氣系統(tǒng)中應(yīng)有空氣過濾裝置。

微生物檢測(cè)的新技術(shù)1.皿膜法—以紙片法為代表紙片法是目前被廣泛接受的方法。國(guó)標(biāo)餐具大腸菌群采用的就是紙片法。優(yōu)點(diǎn)：無需制備培養(yǎng)基，攜帶方便，非漫延菌落計(jì)數(shù)較方便。缺點(diǎn)：檢測(cè)成本相對(duì)偏高。與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)缺乏對(duì)應(yīng)規(guī)律，不能替代傳統(tǒng)檢測(cè)方法，重現(xiàn)性較差。2.微生物生化自動(dòng)鑒定儀代表廠商：BDcrystal,梅里埃VITEK系統(tǒng)，英國(guó)AUTOREAD細(xì)菌鑒定系統(tǒng)。鑒定原理：在細(xì)菌鑒定板中加入指示劑記錄細(xì)菌生長(zhǎng)后發(fā)生的顏色變化，利用統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算生化反應(yīng)的概率。得出生化反應(yīng)的結(jié)果。優(yōu)點(diǎn)：可以完全替代傳統(tǒng)生化反應(yīng)，可一次檢出多種致病微生物，靈敏度高。缺點(diǎn)：仍然需要進(jìn)行傳統(tǒng)增菌培養(yǎng)，成本較高。CRYSTAL生化鑒定結(jié)果3.PCR擴(kuò)增技術(shù)PCR（polymerasechainreaction)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。是近年來發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。1985年由美國(guó)Cetus公司的KaryMullis首創(chuàng)的PCR技術(shù)，可以將微量DNA片段擴(kuò)增一百萬倍以上。PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：敏感度高、特異性強(qiáng)、產(chǎn)率高、重復(fù)性好以及快速簡(jiǎn)便等，廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、考古學(xué)、法醫(yī)學(xué)及體育等領(lǐng)域，并已普及到許多普通實(shí)驗(yàn)室，大大簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)，從而比較容易地對(duì)目的基因進(jìn)行分析、鑒定。二、PCR的原理：5‘3‘5‘3‘5‘3‘5‘3‘5‘3‘5‘3‘5‘3‘5‘3‘5‘3‘5‘3‘5‘3‘5‘3‘5‘3‘5‘3‘94℃變性5MIN55℃退火72℃引物延伸模板變性退火第二次循環(huán)延伸Step1.變性：加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。Step2.退火：溶液溫度降至50～60℃，模板DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合，即退火階段。Step3.延伸：溶液反應(yīng)溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈為模板，利用引物的3’-OH，以反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP）為底物，按5’－3’方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA，即引物的延伸階段。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

1.在0.2mLEppendorff管內(nèi)配置50μL反應(yīng)體系：反應(yīng)物體積（μL）ddH2O35.5PCR緩沖液（10×）5MgCl2（25mmol/L）4dNTP（10mmol/L）2.5引物10.5引物20.5TaqDNA聚合酶1模板DNA12.按下述程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增:1）94℃預(yù)變性3min；2）94℃變性1min；3）55℃退火45sec；4）72℃延伸1min；5）重復(fù)步驟2~4,34次；6）72℃延伸10min；7）End.3.瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結(jié)果配制1％瓊脂糖凝膠，取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物電泳。保持電壓100V。電泳結(jié)束后，在紫外燈下觀察結(jié)果。PCR實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)：1.模板DNA的制備較難。由于食品中成分復(fù)雜，油脂及金屬離子等會(huì)抵制TQP酶的活性，如用煮沸裂解法直接提取DNA，則很難去除油脂等雜質(zhì)。2.假陰性結(jié)果：由于影響PCR的因素很多，擴(kuò)增效