大豆苷原對去卵巢大鼠血清骨代謝指標、骨密度和骨生物力學和骨形態(tài)學的影響

大豆苷原對去卵巢大鼠血清骨代謝指標、骨密度和骨生物力學和骨形態(tài)學的影響

隨著老齡化時代的開始，絕經后骨質疏松癥的發(fā)病率逐年增加。更年期后，由于雌激素的缺乏，骨量減少，骨組織微結構改變，骨脆弱性增加。雌激素治療雖能減少絕經后婦女的骨丟失及骨折發(fā)生率,但同時也增加了患乳腺癌和子宮內膜癌的風險。近年來,植物雌激素以其在女性健康中的潛在作用而成為研究的熱點,為防治絕經后骨質疏松提供了一條新思路。異黃酮(isoflavones)是植物雌激素的一種,主要包括大豆苷原(daidzein)、染料木黃酮(genistein)和黃豆黃素(glycitein),它們的結構與雌激素相似。過去的十多年里,含有異黃酮的大豆或者純化的異黃酮在骨質疏松動物模型中的防治作用和人體骨量減少中的預防保健作用進行了許多研究,結果表明異黃酮一類的植物雌激素對絕經后骨質疏松癥具有一定防治作用。一些研究提示,大豆苷原比染料木黃酮能更有效地預防去卵巢大鼠骨丟失,然而到目前為止,有關大豆苷原對骨質疏松影響的量效關系卻缺乏實驗數據。本實驗通過不同劑量的大豆苷原對去卵巢大鼠骨質疏松癥模型的骨密度、生物力學和形態(tài)學以及骨代謝生化指標的影響,來比較其防治骨質疏松癥的量效關系。1材料和方法1.1實驗動物中心飼養(yǎng)4月齡健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只,體重267.8±21.5g(由復旦大學實驗動物中心提供,合格證號:SCXK(滬)2002-0002),按清潔級標準飼養(yǎng)于復旦大學實驗動物中心(設備合格證號:SYXK(滬)2002-0014)。大鼠可以自由進食和飲水,各組大鼠均無妊娠和生育史,體重無差異。1.2大豆和培根飼料大豆苷原片由山西澳邇藥業(yè)有限公司提供(國藥準字H20056033);戊酸雌二醇由德國先靈公司生產,廣州先靈藥業(yè)有限公司分裝(國藥準字J20030089)。不含大豆和葛根的飼料由中國科學院上海生命科學院提供,其組成(%):玉米38、小麥22、麥皮11、菜粕12、魚粉10、雞蛋3、酵母粉1.5、骨粉1、植物油1、食鹽0.5;營養(yǎng)水平(%):能量(mcal/kg)3.72、蛋白質19.03、脂肪3.45、碳水化合物51.53、粗纖維3.53、鈣0.71、磷0.77、賴氨酸0.80,另按國家飼養(yǎng)標準補充多種微量元素與維生素。1.3大鼠單次給藥和藥物處理60只大鼠隨機分為6組:假手術組(Sham)、去卵巢組(OVX)、去卵巢+戊酸雌二醇手術組(E2)、去卵巢+高劑量大豆苷原手術組(H-Dai)、去卵巢+中劑量大豆苷原手術組(M-Dai)和去卵巢+低劑量大豆苷原手術組(L-Dai)。將大鼠用2%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉后,從后背脊柱旁切口,分次結扎切除雙側卵巢,逐層縫合切口。假手術組大鼠僅切除部分脂肪組織,不切除卵巢。去勢大鼠術后1周連續(xù)觀察陰道涂片5d,證實無動情周期變化,以明確手術成功。術后4周開始給予大鼠藥物,藥物用蒸餾水配制成懸浮液,每只2ml灌胃,Sham組和OVX組均以蒸餾水2ml灌胃,其余各組分別給予戊酸雌二醇800μg/kg·d、大豆苷原200、50、10mg/kg·d。灌胃3月后以頸動脈放血處死大鼠,分離血清,存于-20℃待測;分別取腰椎L1-5和雙側股骨以生理鹽水紗布濕敷,存于-20℃待行以下測定。1.4elisa試驗用Olympus,AU2800全自動生化分析儀測定血清Ca(Ca)、血清磷(P)和血清骨堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP),用ELISA試劑盒測定血清雌二醇(E2)和骨鈣素(osteocalcin,BGP)的水平。1.5density,bmd腰椎骨(L1-5)和左股骨的骨密度(bonemineraldensity,BMD)用美國Hologic公司雙能X線骨密度儀(精度1%;CV<1%,g/cm2)測量,掃描類型:hHi-Res,模型:DiscoveryA(S/N80347)。1.6種彎曲裝置取股骨(右)與腰椎(L3)標本剔除肌肉與軟組織后,分別在美國INSTRON公司萬能材料測試儀(精度0.04%)的三點彎曲裝置(跨度18mm;速率10.0mm/min)與壓縮裝置上測試股骨最大三點彎曲載荷與腰椎最大壓縮載荷,結果以牛頓力(N)表示。1.7脫鈣、酒精脫水取腰椎(L4)標本剔除肌肉與軟組織后,投入到4%多聚甲醛中,4℃固定48h,用10%EDTAPBS(pH7.4)于4℃冰箱脫鈣3~4周,隔天換1次脫鈣液,以細針刺入為脫鈣終點,取出蒸餾水沖洗,梯度濃度酒精脫水。腰椎于1/2處切斷取材,石蠟包埋,HE染色,在100倍光鏡下觀察腰椎骨小梁微結構,應用Mediaplayer公司的Image-ProPlusIPP形態(tài)計量軟件分析,計算椎體骨小梁與椎體總面積比值,結果以百分比(%)表示。1.8統(tǒng)計處理所有數據輸入SPSS11.5進行分析,計量資料以xˉ±sxˉ±s表示,組間比較用單因素方差分析,P<0.05認為差異具有顯著意義。2大豆苷原治療對大鼠腰椎和股骨bmd的影響實驗動物60只,去卵巢手術或灌胃后死亡4只,共56只動物進入結果分析。2.1骨代謝生化指標表1顯示治療3月后不同組間血清鈣和磷的水平差異沒有顯著性(P>0.05);OVX組血ALP和BGP較其余各組顯著增高(P<0.05、P<0.01),其余各組間(包括3個劑量Dai組)差異沒有顯著性(P>0.05);OVX組血清E2比其余組顯著降低(P<0.05、P<0.01),但3個劑量Dai組間差異沒有顯著性(P>0.05)。2.2骨密度如表2所示,本研究中OVX組大鼠的腰椎和股骨的BMD低于Sham組,經過E2治療后均有提高,差異有顯著性(P<0.01);經過大豆苷原治療后,除了H-Dai組大鼠的股骨BMD外,其余組腰椎和股骨的BMD均顯著性提高(P<0.01);其中L-Dai組大鼠腰椎BMD的增高比中、高劑量組明顯,股骨BMD的增高比高劑量組明顯,差異有顯著性(P<0.05、P<0.01);而中、高劑量組間的差異沒有顯著性(P>0.05)。2.3骨生物力學表3顯示OVX組大鼠腰椎(L3)最大壓縮載荷和右股骨最大三點彎曲載荷比Sham組降低,經過E2治療后有提高,但只有腰椎最大壓縮載荷這一指標的差異有顯著性(P<0.01)。經過大豆苷原治療后,大鼠腰椎最大壓縮載荷均得到明顯改善(P<0.05、P<0.01),但是三種劑量的Dai組間差異沒有顯著性(P>0.05);大鼠右股骨最大三點彎曲載荷僅L-Dai組高于OVX組,并且顯著高于中、高劑量組(P<0.05、P<0.01),而后兩組間的差異沒有顯著性(P>0.05)。2.4骨組織形態(tài)計量鏡下可見OVX組大鼠腰椎(L4)骨小梁明顯變細、數量下降、排列稀疏,有大量脂肪細胞,給予E2治療后骨小梁數量增多,小梁增寬,間隙變小;組間椎體骨小梁與椎體總面積比值的差異均有顯著性(P<0.01)。給予大豆苷原治療后,大鼠骨小梁與椎體總面積比值也比OVX組有明顯提高(P<0.05、P<0.01),但是中、高劑量組大鼠明顯不及L-Dai組(P<0.01),而后兩組間的差異沒有顯著性(見表4、圖1~6)。3各組細胞功能代謝性未孕產的雌性大鼠,3~6月齡時骨生長活躍,為研究峰值骨量影響因素的最佳時機。雌性大鼠去卵巢3月之后,血雌二醇含量明顯下降,破骨細胞活動加速,成骨細胞功能代償性增強,骨吸收大于骨形成,起初有一個快速的以松質骨丟失為主的階段,松質骨的骨量減少,骨強度下降,可形成骨質疏松癥的模型。本實驗中OVX組大鼠血清E2水平以及腰椎的BMD、最大壓縮載荷、骨小梁與椎體總面積比值,股骨BMD和最大三點彎曲載荷均比Sham組降低,經過E2治療后大鼠的這些指標均比OVX組增加,雖然股骨最大三點彎曲載荷項目的差異無顯著性,但仍然反映本實驗中模型的成功建立,而且驗證了雌二醇防治骨質疏松癥的有效性。3.1大豆苷元、大豆異黃酮、alp、bgp的檢測生物體通過骨、腸和腎的相互聯(lián)系、相互制約,使血鈣和鈣離子調控達到正常水平。血漿和細胞外液的磷酸離子濃度是骨礦形成和吸收的關鍵性因素,過高和過低對骨基質的合成和礦化都不利。本實驗各組間的血Ca和血P水平差異沒有顯著性,說明經過機體不斷調節(jié)使其保持在一個較穩(wěn)定的狀態(tài)。ALP在骨組織形成過程中大量產生,有利于骨骼形成,在肝功能正常的情況下能反映骨轉換率的強度,是評價骨形成的指標。BGP只有成骨細胞可以合成,它經成骨細胞合成后沉積于骨,部分可彌散入血,測定血液中新合成的微量水平可以反映成骨細胞的活性。在本實驗中相對于Sham組,OVX組大鼠血清ALP和BGP顯著升高,表現(xiàn)出典型的高轉換型骨質疏松的生化特點,這與許多文獻報道的結果相似。經過E2和大豆苷原治療后,兩者水平顯著降低,這與有關大豆異黃酮的研究報道相似。機體內雌激素水平的高低與骨代謝密切相關,雌激素水平下降是絕經后婦女骨質疏松癥發(fā)病率增高的主要原因,而補充雌激素可以促進骨生成,抑制骨吸收。大豆異黃酮的結構與雌激素相似,可以與雌激素受體(estrogenreceptors,ERs)結合,發(fā)揮弱雌激素作用,動物實驗證實去除卵巢大鼠給予大豆異黃酮能夠提高血清雌激素水平。本實驗中去卵巢大鼠血清E2水平下降,經過大豆苷原治療后均有明顯提高,可能是由于灌胃大豆苷原在一定程度上激活靶細胞核和膜上的ERs,影響內源性雌激素的分泌。綜上所述,外源性大豆苷元能使去卵巢大鼠血清Ca、P處于較適的骨形成狀態(tài);使ALP和BGP處于相對低的水平,說明它可能通過抑制骨的重吸收而改善骨量;大鼠去卵巢后在內源性雌激素不足的情況下外源類雌激素物如大豆苷元使周圍血清雌激素產生顯著的提高,這些都可能ERs的存在和活性有關,需進一步研究。3.2大豆苷原對去卵巢大鼠體內小鼠骨保護作用的影響B(tài)MD是評價骨強度的基本指標,指骨骼單位面積中礦物質的含量,一般用DEXA方法測定;骨生物力學可以間接反映骨骼的骨礦鹽分布、骨小梁的空間結構等結構形態(tài)學特征,進而評價發(fā)生骨折的風險,常用的測量指標包括:骨干三點彎曲最大載荷以及椎體骨最大壓縮載荷等;骨組織形態(tài)計量學技術是通過獲得骨小梁數目、間隔、厚度面積百分率等方面的資料來反映骨量和微結構的變化,本實驗選用腰椎骨小梁與椎體總面積比值這一指標。本實驗中去卵巢大鼠經過大豆苷原治療3月后,腰椎和股骨BMD、生物力學和骨形態(tài)學等指標上較OVX組有不同程度的增高,其中以10mg/(kg·d)大豆苷原組最為顯著,各項指標的差異均有顯著性;50mg/(kg·d)大豆苷原組大鼠相比于低劑量組開始顯示效果降低的趨勢,它們在腰椎的BMD、骨小梁與椎體總面積比值以及股骨最大三點彎曲載荷等指標都明顯低于低劑量組大鼠;200mg/(kg·d)大豆苷原組大鼠相比于低劑量組效果降低的趨勢更明顯,除了腰椎的最大壓縮載荷之外,其余指標均明顯低于低劑量組大鼠。本實驗結果提示大豆苷原對去卵巢大鼠骨質疏松有一定的防治作用,其骨保護作用可能是劑量依賴性的,存在一定的量效關系,低劑量時作用更為顯著,中、高劑量時作用逐漸減弱。1998年Anderson等發(fā)現(xiàn),小劑量的染料木黃酮(0.5mg/d)可能比給予中等和高劑量的染料木黃酮(分別為1.6mg和5mg/d)有更顯著的骨保護作用,因此他提出染料木黃酮的骨保護作用是劑量依賴性的,可能最終發(fā)揮雙相作用,這提示異黃酮不僅影響骨吸收,也影響骨形成。目前對這種雙相作用的機制尚未十分清楚,Dang等對成骨細胞和骨前體細胞的研究發(fā)現(xiàn),ERs和過氧化物酶增殖子激活受體(peroxisomeproliferator-activatedreceptors,PPARs)可能在其中發(fā)揮重要作用,異黃酮在低濃度時,以ERs介導的作用為主,表現(xiàn)為骨生成增加,脂肪生成減少,在高濃度時,以PPARγ介導的作用為主,脂肪生成增加,骨生成減少。但是這仍需要更多的實驗來驗證,尤其是體內實驗。對動物模型和人體的研究中也發(fā)現(xiàn)存在雙相劑量依賴性關系,但由于劑量選擇的不同、治療的時間和長度、不同模型的不同反應,不同研究之間的結果差異較大,一些試驗表現(xiàn)為骨保護作用,而另一些則無此