生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：DNA的瓊脂糖凝膠電泳

DNA的瓊脂糖凝膠電泳一、實(shí)驗(yàn)原理

DNA分子在pH值高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向陽極移動(dòng)。DNA分子在電場中通過瓊脂糖凝膠而泳動(dòng)，除了電荷效應(yīng)以外，還有分子篩效應(yīng)。由于DNA分子片段的大小、構(gòu)象不同，移動(dòng)速度也不同，所以可將大小不同或構(gòu)象不同的DNA分離。1.0%的瓊脂糖適合分離約0.5-7kb的核酸分子。最常用的緩沖液是pH8.3的TBE緩沖液（0.89mol/LTris-Acetate和0.002mol/LEDTA）電泳過程中需要使用指示劑指示核酸遷移的情況，常用的指示劑為溴酚藍(lán)（Bb，藍(lán)紫色）。它分子量僅670，可自由通過分子篩，近似于自由電泳，在不同濃度的膠中遷移速度基本相同。按所需分離的核算分子的大小，可以根據(jù)指示劑遷移情況來決定電泳的時(shí)間。1.0%的瓊脂糖凝膠中，0.6kb的雙鏈DNA片段與Bb遷移速度大致相同。還需要加入蔗糖或甘油來增加比重，使樣品能沉入膠孔。瓊脂糖凝膠電泳分離后的DNA用溴乙啶EB染色后能顯示出條帶。溴化乙啶分子可插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩個(gè)堿基之間，形成一種熒光絡(luò)合物。在紫外光照射下，呈現(xiàn)橙黃色（波長590nm）的熒光。染色液可在電泳結(jié)束后進(jìn)行，也可在電泳前加入，并且因?yàn)镋B-DNA復(fù)合物熒光強(qiáng)度比EB本身強(qiáng)很多倍，一般無須洗去就能觀察到核酸電泳帶。二、試劑與材料1、1.0%瓊脂糖：1g溶于100ml緩沖液中加熱溶解。2、pH8.3,Tris-硼酸-EDTA緩沖液（TAE）3、標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液4、10mg/ml溴乙啶染色液（EB）5、電泳板電泳槽6、移液槍吸頭等7、玻璃制品三、操作方法

1.0%瓊脂糖凝膠板的制備：稱取1g瓊脂糖，置于三角燒瓶中，加入100mlpH8.3TAE緩沖液，加熱使充分溶解。取出自然冷卻至60°C左右，加入10mg/mlEB

5μL，混勻后倒入已放置梳子的電泳板，室溫冷卻放置45min左右，待凝固垂直拔出梳子。預(yù)電泳：將制備好的凝膠板進(jìn)入電泳槽中，3-5mA/cm預(yù)電泳30min。加樣PCRmarker：1μLmarker+1μL加樣緩沖液+4μLTAE混勻加入孔中PCR樣品：5μL樣品DNA+1μL加樣緩沖液混勻后一次加入孔中電泳接上電源電壓120V電流50mA進(jìn)行電泳

結(jié)果觀察戴上手套取出凝膠板，瀝去殘留液體，倒扣在紫外燈上觀察結(jié)果。熒光強(qiáng)弱由DNA含量決定，而DNA遷移率則反映了DNA片段的大小。四、注意事項(xiàng)溴乙錠是致癌物，操作時(shí)戴防