轉(zhuǎn)基因番茄植株中通過細(xì)菌酶的表達(dá)調(diào)控乙烯合成

轉(zhuǎn)基因番茄植株中通過細(xì)菌酶的表達(dá)調(diào)控乙烯合成摘要：乙烯，作為一種植物激素，其合成對于植物的多種發(fā)育過程是至關(guān)重要的。乙烯對于躍變型果實和蔬菜成熟過程的調(diào)控是其中最具特點的。降低乙烯合成的方法之一是調(diào)控乙烯的直接前體物質(zhì)，1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）。土壤細(xì)菌中含有一種酶，稱為ACC脫氨酶，這種酶可以使土壤細(xì)菌把ACC作為唯一氮源而生長。編碼ACC脫氨酶的基因已被成功轉(zhuǎn)入番茄植株。轉(zhuǎn)基因植株中乙烯合成的降低沒有引起任何植物表征的改變。但是，這些轉(zhuǎn)基因植株結(jié)出的果實在成熟過程中卻存在明顯的延遲，而且，已經(jīng)成熟的果實較沒有轉(zhuǎn)基因的植株果實會出現(xiàn)至少六周或者更長的時間才能軟化。這些結(jié)果都表明，ACC脫氨酶對于檢驗乙烯在植物諸多發(fā)育過程和應(yīng)急過程具有重要作用，同時還可以檢驗對那些被乙烯調(diào)控成熟的過程的果實和蔬菜的保質(zhì)期的影響。引言乙烯是一種強(qiáng)有力的植物生長調(diào)控因子，影響多種生長發(fā)育過程，包括果實的成熟，衰老，以及應(yīng)激反應(yīng)。尤其是在躍變型果實的成熟過程中具有重要作用。乙烯合成和作用的化學(xué)抑制劑會使多種植物物種的果實成熟及花的衰老過程完全停止。在分子水平上，乙烯被認(rèn)為是能夠誘導(dǎo)許多基因的表達(dá)，其中包括成熟和病原體反應(yīng)過程中涉及的基因。乙烯從S-腺苷甲硫氨酸通過中間物質(zhì)ACC進(jìn)而合成得到。近期，編碼ACC合成酶和ACC氧化酶的cDNA克隆成功。這些后來的基因的cDNA反向表達(dá)就會導(dǎo)致乙烯合成的減少和減慢離體的番茄果實的成熟。在植物中，對于乙烯合成抑制的效力，要去除外源性功能作用以及其他化學(xué)抑制劑的攝取，應(yīng)該允許確定的實驗可以闡明乙烯在不同發(fā)育過程和應(yīng)激反應(yīng)現(xiàn)象中起的精確作用。在這里我們提供了一套系統(tǒng)來顯示生長和生殖組織中的乙烯合成的下降，并描述其在番茄果實成熟過程中的影響。結(jié)論對于ACC降解酶的克隆阻止乙烯合成的方法一般來說包括將乙烯前體，ACC，不可逆地降解，轉(zhuǎn)化成非活性的復(fù)合物。目前，對于乙烯在植物體中的生物合成的認(rèn)識指出，ACC是生理條件下乙烯合成過程的中間代謝前體。除了乙烯生物合成途徑外，只有兩種ACC的代謝反應(yīng)是已知的。一種從土壤細(xì)菌，Pseudomonassp菌株ACPC中分離出來的，可以將ACC轉(zhuǎn)化為a-丁酮酸的酶，另一種酶實在植物體中發(fā)現(xiàn)，可以將ACC?；杀CC。我們通過以最小中間產(chǎn)物ACC作為唯一氮源的情況下，機(jī)體的生長能力為指標(biāo)，對具有ACC降解酶的近600種土壤細(xì)菌進(jìn)行了篩選。其中，兩種細(xì)菌從篩選對象中分離，并進(jìn)一步鑒定。經(jīng)過鑒定，均為Pseudomonas種。我們選擇了其中之一的Pseudomonassp菌株6G5做進(jìn)一步鑒定。黏粒文庫依據(jù)基因組DNA建立并轉(zhuǎn)入E.coil中。具有黏粒的E.coil細(xì)胞依據(jù)它們以ACC作為唯一氮源時的生長能力來進(jìn)行篩選。一些被分離出來，18種被進(jìn)一步測定。限制性內(nèi)切酶降解模式指出，所有的黏?？寺《及粋€6G5基因組的重疊區(qū)域。隨后的亞克隆以及針對ACC作為中間產(chǎn)物最小劑量的生長情況的篩選，他們使用一個包含ACC降解酶基因的2.4kb的DNA片段。這個片段是基于DNA測序分析得出，顯示出一個1017個核苷酸的單一開放閱讀框，編碼一個分子量36800的蛋白質(zhì)分子，如圖一所示。ACC降解酶的測定因為ACC降解酶的活性在先前的文件中已經(jīng)有報道，依據(jù)此性質(zhì)，就可以確定克隆基因中是否編碼了ACC降解酶的序列。E.coli中6G5開放閱讀框也是被設(shè)計成高水平表達(dá)的。圖2中的第二欄表示E.coli中爬M啟動子調(diào)控下的基因表達(dá)情況?？梢钥闯稣_大小的蛋白被表達(dá)出來。細(xì)菌表達(dá)這種蛋白，就顯示其具有將ACC降解為等摩爾的氨和a-丁酮酸的能力。為了確定6G5蛋白的存在，必須獲得早前已經(jīng)鑒定過的有機(jī)體，Pseudomonassp菌株ACPC，利用該有機(jī)體產(chǎn)生的ACC降解酶進(jìn)行純化，并且與已公布的標(biāo)準(zhǔn)做同質(zhì)性檢測。該蛋白經(jīng)過氨基端氨基酸測序，前21個氨基酸已經(jīng)確定。這21個氨基酸種的17個與預(yù)測的6G5序列表達(dá)出來的氨基酸是一致的，剩下不同的4個氨基酸中的2個是保守性的替換。因此6G5序列是編碼ACC降解酶的。先前報道中，有活性的ACC降解酶的分子量為104000，而預(yù)測的亞單位的分子量為36800，可以推測該酶是以三聚體的形式存在的。植物體中ACC降解酶的表達(dá)ACC降解酶基因被放置在花椰菜花葉病毒（CaMV）的35S啟動子之后，并受其調(diào)控，該基因用來轉(zhuǎn)化UC82B番茄植株。然而，CaMV的35S啟動子會在特定的組織中優(yōu)先表達(dá)，在大部分的組織中，啟動子會表達(dá)出可檢測的水平。因為乙烯參與多種植物生理反應(yīng)，因此當(dāng)植物體內(nèi)對于乙烯的抑制時，可能會極大程度影響植物生長過程。然而，有一些的表現(xiàn)性正常的轉(zhuǎn)基因植株可以從這些轉(zhuǎn)化體中篩選出來。如圖2所示，為植物組織中酶蛋白的印記雜交分析，結(jié)果表明，這些植株中很多能夠高水平表達(dá)ACC降解酶的基因，產(chǎn)物量超過總蛋白的0.5%。植物體的新葉組織中ACC降解酶表達(dá)最高的兩個通道被用作乙烯生成分析。如表1所示，ACC降解蛋白表達(dá)最高的通道，5673，乙烯生成量降低了90%。在第二個實驗中，這條通道顯示出更高的效力，乙烯生成量的降幅達(dá)到97%。在ACC降解蛋白表達(dá)次高的通道，5854中，乙烯的降幅也達(dá)到了78%。這些數(shù)據(jù)都是由基因表達(dá)數(shù)據(jù)組合而成的?；谟∮浄磻?yīng)的數(shù)據(jù)，5673通道的ACC降解酶包含了大約0.5%的可溶性蛋白，而5854包含了大約0.05%。純和植株5673根據(jù)其表型效應(yīng)進(jìn)行檢測。通過轉(zhuǎn)基因植株獲得的種子正常發(fā)芽，長出的植株與對照組在表型上并沒有什么區(qū)別。同時，植株在花期和成熟期并沒有出現(xiàn)延遲的情況，然而，他們卻在成熟的過程上有著明顯的不同。圖3所示為，植株5673和UC82B的果實雖然在3天的時候乙烯的量都達(dá)到了峰值，但是5673果實的乙烯合成水平僅是UC28B的10%。表2和圖4都表明了采摘后在破色期的果實延遲成熟的情況。對照組的果實經(jīng)過7天從破色期到紅熟期，僅僅2周后就出現(xiàn)明顯的軟爛。轉(zhuǎn)基因組的果實經(jīng)過24天后達(dá)到紅熟期，并且在很長一段時間保持果實硬實。圖4A圖示在破色期摘下的果實，并將其放在室溫下7天讓其成熟。圖4B圖示了在破色期就摘下，室溫儲存4個月的果實過分成熟的的情況，而這種果實是有ACC降解酶表達(dá)的。圖4C則圖示了在植株上生長成熟的果實在同樣條件下的情況。轉(zhuǎn)基因的果實在超過40天的生長下仍然硬實并且沒有脫落，而對照組的果實14天就脫落。討論乙烯是已知的可以促進(jìn)躍變型果實成熟的因素，并且是由ACC轉(zhuǎn)化合成。因為ACC是目前已知參與到乙烯合成代謝途徑的物質(zhì)，所以，ACC的降解可能是乙烯合成過程中唯一起著生物化學(xué)上具有重要的抑制作用?？赡苁且驗樗ダ辖M織中具有大量的ACC以及其代謝物丙二酰-ACC，因此具有降解ACC能力的微生物很容易從土壤中分離出來。我們在四大洲獲得的樣本中獨立分離出來具有ACC降解酶的細(xì)菌。這些分離的基因轉(zhuǎn)入番茄植株并表達(dá)，使得乙烯的產(chǎn)量大大降低。ACC的降解產(chǎn)物a-丁酮酸自然出現(xiàn)在植物體中。a-丁酮酸是乙酰乳糖合成酶的底物，因此a-丁酮酸在植物體中可以被轉(zhuǎn)化成氨基酸側(cè)鏈。很有意思的是，實驗組一些組織，例如，葉片和果實中的乙烯合成量大幅減少，這種現(xiàn)象除了正在成熟的果實中外，與對照組相比沒有明顯差別。這些結(jié)果證明了直到果實成熟之前，乙烯在植物生長中起到的作用不大。這也說明，轉(zhuǎn)基因植株中持續(xù)合成的乙烯對于一般番茄的生長也是足夠的。在實驗室條件下，擬南芥的一種表形正常但對乙烯不敏感的突變的存在，證明了，乙烯對于植株的作用與實驗組直到果實成熟之前，乙烯在植物生長中起到的作用不大的情況一致。相反地，乙烯似乎是環(huán)境或生理條件改變至關(guān)重要的信號，例如在果實成熟期或者應(yīng)急反應(yīng)中。在這種情況下，環(huán)境對于轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)微差別是無法去除的。另一種減少乙烯合成的方法，包括一種反轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)，會導(dǎo)致這種內(nèi)源性的生物合成途徑關(guān)閉。這種方法已經(jīng)被證明能夠有效延遲果實的成熟。因為ACC合成酶與ACC氧化酶都是多基因家族，每種酶的表達(dá)都是有嚴(yán)格的時效性和空間性，很難評價在不同器官中對于乙烯合成的抑制的效用。本文中所提及的方式是可以在植株各個部位減少乙烯合成的。此外，ACC脫氨酶通常用作乙烯在抗病性、環(huán)境應(yīng)激性以及發(fā)育等方面所起作用的研究。在表達(dá)編碼ACC脫氨酶的基因的轉(zhuǎn)基因番茄中，乙烯的抑制效用和成熟過程的延遲之間存在一定聯(lián)系。對于儲存在室溫下的轉(zhuǎn)基因番茄果實的直觀觀察也表面，軟化過程存在著明顯的延遲，果實較對照組保持堅硬要長五個月。在同樣的時間，如圖4B所示，對照組果實早已完全干癟。ACC的降解會阻礙乙烯的合成，但是不會影響果實感知乙烯的能力，這好似因為，轉(zhuǎn)基因果實一般是暴露于外源性乙烯中催熟的。所有這些因素表明，ACC脫氨酶會會使得番茄或其他躍變果實和蔬菜顯著延長儲存期。方法微生物的篩選對保存的600種細(xì)菌菌株依據(jù)其分解ACC的能力進(jìn)行篩選。大部分的微生物都是具有熒光的Pseudomonas種，剩下的微生物在土壤中很據(jù)代表性。篩選是設(shè)計成選擇那些在ACC作為唯一氮源，濃度只有3.0mM的最小值仍然可以生長的微生物。樣品在96孔微量板30°C條件下培養(yǎng)4天。每個孔中包含0.2mLDF鹽溶液，該溶液除去其他氮源，只保留ACC，含0.2%葡萄糖、0.2%葡萄糖酸、0.2%檸檬酸。篩選出來三種在含有ACC基質(zhì)中生長的微生物。他們可以在含有ACC的基質(zhì)中生長，這一現(xiàn)象通過將這些微生物再次在300mL同樣的液體培養(yǎng)基中的生長來證明。選擇在ACC基質(zhì)中生長最好的兩個菌種，分別標(biāo)記為3F2和6G5,再做進(jìn)一步分離。為了準(zhǔn)備從Pseudomonassp菌株的6G5菌株中獲得染色體DNA，在LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，約200mL。將這些細(xì)胞收集起來，并重懸于10mL由25mMTris-HCl、pH為8、10mMEDTA所配成的溶液中。最后加入濃度為1%的SDS溶液，將此懸浮液進(jìn)行三次冷凍溶解循環(huán)，每個循環(huán)包括，將懸浮液放入干冰15分鐘，再放入70C水浴10分鐘。之后，用等體積的苯酚、氯仿將該溶解產(chǎn)物萃取4次，再用乙醇使其沉淀。沉淀物重懸于5mL由10mMTris、pH為7.5、1.0mMEDTA所配成的溶液中。6G5DNA被EcoRI部分分解，根據(jù)其大小分離在10%?40%的蔗糖濃度梯度溶液中。包含超過20kbDNA片段的碎片都被匯集在一起。由EcoRI切的pMON17016片段構(gòu)成黏粒庫，這個片段是黏粒載體 pHC79的衍生物。pMON17016質(zhì)粒中具有一個T7噬菌體中提出10啟動子基因連接的克隆位點。黏粒文庫被轉(zhuǎn)入久噬菌體中，通過廠商加工，再被轉(zhuǎn)入￡^阮r，c加aco〃MM294。為了篩選具有ACC脫氨酶基因的黏?？寺。瑢⑽膸煸诎?mMACC作為唯一氮源的M9基質(zhì)上涂平板。將平板在37C條件下培養(yǎng)3天。大約56000個黏粒中的300個（每200中的一個）可以在平板上生長。ACC脫氨酶的活性可以由其分解產(chǎn)物a-丁酮酸及氨的含量來測定。a-丁酮酸通過2,4-二硝基苯肼的衍生物來測定。氨通過谷氨酸脫氫酶測定工具來測定，該工具由Sigma公司出品。a-丁酮酸是通過反相離子高效液相色譜將固定相與其共洗脫來確定。檢測的混合物需要用乙酸乙酯萃取2次，并棄水相。乙酸乙酯部分再用10%碳酸鈉萃取，并將得到的水相直接加入C-18層析柱。樣品在同等條件下用60%的甲醇，1.5%乙酸和1.0mM的四丁胺磷酸作為離子配對劑進(jìn)行洗脫。洗脫物用分光光度計在374nm下檢測。一個長度為10.6kb的BamHI-Xbal片段包含ACC脫氨酶活性，此片段從一個黏粒中亞克隆并轉(zhuǎn)入pUC118中。隨后通過HindIII和Smal切割，將具ACC酶活性的片段長度縮小至2.4kb。這條鏈通過美國生物化學(xué)公司DNA測序工具進(jìn)行測序，一個長1017bp的ACC脫氨酶基因的開放閱讀框被分離出來。蛋白質(zhì)測序純化過的ACC脫氨酶利用埃德曼分解法進(jìn)行自動測序，測序儀器為應(yīng)用生物系統(tǒng)470A蛋白質(zhì)測序儀。細(xì)菌基因的表達(dá)和抗體的制備Ndel位點是在ATG起始位點上引進(jìn)的由ACC脫氨酶開放閱讀框直接誘變得到的。這個基因被亞克隆為一段1127bp的Ndel-Hindlll片段，并轉(zhuǎn)入E.coli表達(dá)載體中，該載體包含recA啟動子和基因10前導(dǎo)序列。這個質(zhì)粒，pMON10078，被轉(zhuǎn)入E.coliW3110中，并置于50pg/mL的萘啶酸中，37°C培養(yǎng)20小時，使基因表達(dá)。細(xì)胞顆粒進(jìn)行再懸和超聲波處理1分鐘，使可溶性和不可溶性的片段在10%?20%的變性膠進(jìn)行跑膠。最大的條帶的分子量大約37000，聯(lián)系到我們預(yù)測的ACC脫氨酶的分類為36800，條帶出現(xiàn)在不溶性的部分。樣品依據(jù)其氨基末端的氨基酸序列測定。用1.5mg蛋白感染山羊來得到抗體。ACC脫氨酶在番茄內(nèi)的表達(dá)一個從pMON10027質(zhì)粒中提取的，長度為1071bp，含有ACC脫羧酶開放閱讀框的EcoRv-Sacl片段，被克隆到轉(zhuǎn)運載體pMON893中。這個過程講開放閱讀框添加到復(fù)制的CaMC35S啟動子上和豌豆的rbcS-E9基因3’末端。這個質(zhì)粒載體利用協(xié)助質(zhì)粒pRK2013通過三親本聯(lián)合體