制備液相色譜技術(shù)(LC-MS)課件

高效制備液相色譜技術(shù)高效制備液相色譜技術(shù)1高效制備液相色譜的原理：色譜分離原理無論是分析型色譜還是制備型色譜都是相同的，那就是色譜理論。

但是在理論的遵循上，制備型有時(shí)需打折扣。這是由于兩種類型的色譜最終的目的是不同的。分析型色譜：分離度高，靈敏度高，以含量測(cè)定為目的。制備型色譜：要求純度、產(chǎn)量和收益。高效制備液相色譜的原理：色譜分離原理無論是分2

經(jīng)典的制備色譜方法與高效制備液相色譜的異同及優(yōu)缺點(diǎn)：相同：目的相同；某些方法原理也相同。不同：自動(dòng)化程度不同，效率不同，分離復(fù)雜化合物的能力不同。經(jīng)典制備色譜方法：柱色譜、薄層色譜……經(jīng)典的制備色譜方法與高效制備液相色譜的異同及3制備液相色譜技術(shù)(LC-MS)課件4制備液相色譜技術(shù)(LC-MS)課件5制備液相色譜技術(shù)(LC-MS)課件6高效制備液相色譜優(yōu)點(diǎn)：效率高，收率相對(duì)較高，特別適合復(fù)雜樣品、性質(zhì)接近化合物的純化。純化效果理想。缺點(diǎn)：設(shè)備復(fù)雜昂貴，投資大，運(yùn)行費(fèi)用較高。經(jīng)典制備色譜方法優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，投資小，見效快。能滿足一般樣品的純化要求。缺點(diǎn)：效率低下，收率低，對(duì)于過于復(fù)雜的化合物，純化效果不理想。高效制備液相色譜經(jīng)典制備色譜方法7制備液相色譜又稱純化系統(tǒng)，是目前高效率制備純化合物最有力的方法，廣泛應(yīng)用于：1.天然產(chǎn)物的分離與純化2.合成藥物的純化3.合成反應(yīng)中間產(chǎn)物或副產(chǎn)物的制備4.手性藥物的分離與純化5.藥物雜質(zhì)的分離制備......制備液相色譜又稱純化系統(tǒng)，是目前高效率制備純8制備液相色譜技術(shù)(LC-MS)課件9重復(fù)性重復(fù)性10選擇性要求選擇性要求11色譜柱吸附等溫線正常載荷(loading)：色譜柱吸附等溫線正常載荷(loading)：12色譜柱吸附等溫線超載(overloading)：色譜柱吸附等溫線超載(overloading)：13純度（purity)、產(chǎn)量（throughput）和收益（yield）（PTY）三者的關(guān)系純度（purity)、產(chǎn)量（throughput）14濃度過載和體積過載濃度過載和體積過載15濃度過載和體積過載色譜示意圖濃度過載和體積過載色譜示意圖16什么時(shí)候使用濃度過載?什么時(shí)候使用體積過載?一般情況下，由于需要有較大的throughput，所以濃度過載使用較多，但當(dāng)樣品濃度過稀，又沒有合適的方法濃縮時(shí)或流動(dòng)相溶解樣品的能力較弱時(shí)，這時(shí)就應(yīng)當(dāng)使用體積過載。什么時(shí)候使用濃度過載?一般情況下，由于需要有較17由分析型色譜如何擴(kuò)展到制備型色譜？擴(kuò)展計(jì)算由分析型色譜如何擴(kuò)展到制備型色譜？擴(kuò)展計(jì)算18擴(kuò)展計(jì)算擴(kuò)展計(jì)算19擴(kuò)展計(jì)算舉例r1=1.5mm,r2=10.6mm,V1=0.6mL/min

V2=?計(jì)算結(jié)果：30mL/min擴(kuò)展計(jì)算舉例r1=1.5mm,r2=10.6mm,V120=30ml/min擴(kuò)展計(jì)算舉例?計(jì)算結(jié)果25mg=30ml/min擴(kuò)展計(jì)算舉例?計(jì)算結(jié)果25mg210.35mL/min流速下的色譜圖（分析型）0.35mL/min流速下的色譜圖（分析型）22經(jīng)擴(kuò)展計(jì)算，采用不同的柱徑、進(jìn)樣量和流速樣品的色譜圖經(jīng)擴(kuò)展計(jì)算，采用不同的柱徑、進(jìn)樣量和流速樣品的色譜圖23上述五種色譜狀態(tài)的參數(shù)：上述五種色譜狀態(tài)的參數(shù)：24在分析型色譜柱上，不同進(jìn)樣量的色譜圖在分析型色譜柱上，不同進(jìn)樣量的色譜圖25在制備型色譜柱上的色譜圖在制備型色譜柱上的色譜圖26制備液相餾分收集的三種方式1.基于時(shí)間（Time-based）2.基于峰（peak-based）3.基于質(zhì)量（Mass-based）制備液相餾分收集的三種方式1.基于時(shí)間（Time-base27基于時(shí)間（Time-based）根據(jù)餾分的保留時(shí)間及其色譜峰寬，以時(shí)間作為餾分收集器動(dòng)作的指令參數(shù)。特點(diǎn)：參數(shù)設(shè)置方便，樣品收益高、損失少。色譜保留時(shí)間的不穩(wěn)定會(huì)影響到餾分的純度和收益?；跁r(shí)間（Time-based）根據(jù)餾分的保28Time-based用峰的時(shí)間分割，按峰收集餾分色譜峰重疊嚴(yán)重，重疊面積很大，收集到的兩個(gè)餾分將明顯不純。－－－這時(shí)應(yīng)考慮使用Time-based。Time-based用峰的時(shí)間分割，按峰收集餾分29Time-basedTime-based30基于峰（Peak-based）根據(jù)色譜峰的正負(fù)斜率，觸發(fā)餾分收集器，以色譜峰正負(fù)斜率作為餾分收集器動(dòng)作的指令參數(shù)。特點(diǎn)：餾分純度高。餾分保留時(shí)間的不穩(wěn)定不會(huì)影響到餾分的純度。參數(shù)設(shè)置不方便（斜率參數(shù)需計(jì)算）；受色譜峰峰形改變的影響較大。樣品收益低?；诜澹≒eak-based）根據(jù)色譜峰的正31利用正、負(fù)斜率按峰進(jìn)行餾分收集。Peak-based

正、負(fù)斜率和閾值可預(yù)先設(shè)置。當(dāng)色譜信號(hào)都超出預(yù)先設(shè)置的正斜率和閾值兩個(gè)參數(shù)時(shí)，將觸發(fā)峰的收集信號(hào)；當(dāng)色譜信號(hào)低于閾值或低于預(yù)先設(shè)置的負(fù)斜率時(shí)，將觸發(fā)停止收集信號(hào)。設(shè)置閾值的目的是為了消除噪聲的影響。利用正、負(fù)斜率按峰進(jìn)行餾分收集。Peak-based32制備液相色譜技術(shù)(LC-MS)課件33Peak-based實(shí)例（只收集后面這一組分）Peak-based實(shí)例（只收集后面這一組分）34基于質(zhì)量（Mass-based）根據(jù)餾分的質(zhì)量作為指令參數(shù)，觸發(fā)餾分收集器。特點(diǎn)：餾分純度高、且收益高；餾分保留時(shí)間以及色譜峰峰形改變都不會(huì)影響到餾分的純度；參數(shù)設(shè)置方便；需配備MS檢測(cè)器，設(shè)備費(fèi)用投入較大?；谫|(zhì)量（Mass-based）根據(jù)餾分的質(zhì)35Mass-based當(dāng)使用按質(zhì)量進(jìn)行餾分收集時(shí)，只有當(dāng)MSD檢測(cè)到色譜峰含有目標(biāo)質(zhì)量數(shù)，且該目標(biāo)質(zhì)量數(shù)的強(qiáng)度超出特定的閾值時(shí)，餾分收集才被觸發(fā)。這就確保了在每次進(jìn)樣中只收集含目標(biāo)化合物的餾分。大部分情況下只有一個(gè)餾分。不足之處是注入的其他樣品組分不能回收。Mass-based當(dāng)使用按質(zhì)量進(jìn)行餾分收集36按質(zhì)量數(shù)進(jìn)行餾分收集的結(jié)果按質(zhì)量數(shù)進(jìn)行餾分收集的結(jié)果37三種餾分收集方式的比較三種餾分收集方式的比較38它們與純度、產(chǎn)量和收益（PTY）的關(guān)系怎樣？結(jié)合實(shí)際需求合理選擇。三種餾分收集方式如何選擇？它們與純度、產(chǎn)量和收益（PTY）的關(guān)系怎樣？結(jié)合實(shí)際需求合理39制備液相色譜技術(shù)(LC-MS)課件40制備液相色譜技術(shù)(LC-MS)課件41制備液相色譜技術(shù)(LC-MS)課件42制備液相色譜技術(shù)(LC-MS)課件43制備液相色譜技術(shù)(LC-MS)課件44高效制備液相色譜流路示意圖高效制備液相色譜流路示意圖451、延遲體積校正

2、擴(kuò)散影響兩個(gè)問題：1、延遲體積校正

2、擴(kuò)散影響兩個(gè)問題：46什么是延遲體積？理想情況下，當(dāng)檢測(cè)器檢測(cè)到組分信號(hào)時(shí)，同一時(shí)刻，組分也被餾分收集器收集到。實(shí)際情況下，這是做不到的，因?yàn)榇嬖谝粋€(gè)延遲體積。延遲體積：檢測(cè)池到餾分收集器之間管路的體積。什么是延遲體積？理想情況下，當(dāng)檢測(cè)器檢測(cè)到47高效制備液相色譜流路示意圖高效制備液相色譜流路示意圖48延遲體積校正后運(yùn)行時(shí)間：是指分析物組分從檢測(cè)池到餾分收集器所用的時(shí)間。為了準(zhǔn)確地觸發(fā)餾分收集器的啟動(dòng)和停止，必須測(cè)定后運(yùn)行時(shí)間。后運(yùn)行時(shí)間可以轉(zhuǎn)換成與流速無關(guān)的延遲體積。后運(yùn)行時(shí)間測(cè)定方法之一：通過在流路內(nèi)注射一種染料，當(dāng)餾分收集器針尖出現(xiàn)該染料時(shí)記錄時(shí)間。后運(yùn)行時(shí)間＝t餾分收集器-

t檢測(cè)器延遲體積校正后運(yùn)行時(shí)間：是指分析物組分從檢測(cè)49后運(yùn)行時(shí)間測(cè)定方法之二：在餾分收集器內(nèi)裝入一個(gè)檢測(cè)器，該檢測(cè)器稱為延遲傳感器。將延遲校正物注入流路，兩個(gè)檢測(cè)器都記錄信號(hào)。兩個(gè)檢測(cè)器之間的時(shí)間差就是后運(yùn)行時(shí)間。根據(jù)校正時(shí)所用的流速，系統(tǒng)將自動(dòng)計(jì)算出準(zhǔn)確的延遲體積，并保存，同時(shí)也能計(jì)算出每個(gè)流速下的后運(yùn)行時(shí)間，當(dāng)流速改變時(shí)，不需要再校正后運(yùn)行時(shí)間。后運(yùn)行時(shí)間測(cè)定方法之二：50擴(kuò)散擴(kuò)散使峰（譜帶）變寬，嚴(yán)重削弱了色譜的分辨（分離）能力。譜帶變寬與流速成反比，與管線長(zhǎng)度和管線內(nèi)徑成正比。擴(kuò)散擴(kuò)散使峰（譜帶）變寬，嚴(yán)重削弱了色譜的51三種不同管徑的擴(kuò)散影響所以，制備液相色譜中更應(yīng)注意縮短管路的長(zhǎng)度，減少不必要的死體積。三種不同管徑的擴(kuò)散影響所以，制備液相色譜中更52各種類型的制備液相展示各種類型的制備液相展示53制備液相色譜技術(shù)(LC-MS)課件54制備液相色譜技術(shù)(LC-MS)課件55制備液相色譜技術(shù)(LC-MS)課件56制備液相色譜技術(shù)(LC-MS)課件57制備液相色譜技術(shù)(