蛋白質(zhì)組學(xué)研究的進(jìn)展

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的進(jìn)展

通過(guò)收集完整的生物基因序列，尤其是人類骨髓序列的完成，我們?yōu)榱私膺z傳因子在細(xì)胞中的功能關(guān)系提供了基礎(chǔ)，并為人類基因活性和疾病之間的相關(guān)研究提供了強(qiáng)有力的基礎(chǔ)。但是,由于基因表達(dá)往往是通過(guò)基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)產(chǎn)生一個(gè)蛋白質(zhì)前體,在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行加工、修飾,才成為一個(gè)具有生物活性的蛋白質(zhì),所以同樣的一個(gè)基因在不同條件、不同時(shí)間和空間可能不只有一種相應(yīng)的蛋白質(zhì),可能會(huì)有幾種,甚至幾十種對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)存在。另外,這樣的蛋白質(zhì)還需要通過(guò)一系列的運(yùn)輸過(guò)程,到達(dá)細(xì)胞內(nèi)適當(dāng)?shù)奈恢貌拍馨l(fā)揮正常的生理作用。在如此錯(cuò)綜復(fù)雜的表達(dá)過(guò)程中,任何一個(gè)步驟發(fā)生細(xì)微的差錯(cuò)即可導(dǎo)致肌體發(fā)生疾病。研究表明,基因不能完全決定蛋白質(zhì)的后期加工、修飾以及轉(zhuǎn)運(yùn)定位的全過(guò)程。近年來(lái)人們又發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)間亦存在類似于信使核糖核酸(mRNA)分子內(nèi)的剪切、拼接,具有自身特有的活動(dòng)規(guī)律。這種自主性不能從其基因編碼序列中預(yù)測(cè),只能通過(guò)對(duì)其最終的功能蛋白進(jìn)行分析才能了解蛋白質(zhì)在肌體中發(fā)揮的不同作用。正是由于基因組學(xué)無(wú)法回答這些問題,所以,在人類基因組計(jì)劃完成后,科學(xué)家們又進(jìn)一步提出了后基因組計(jì)劃,蛋白質(zhì)組(proteome)研究便是其中一個(gè)很重要的內(nèi)容。蛋白質(zhì)組學(xué)也正是作為功能基因組學(xué)的重要支柱在20世紀(jì)90年代應(yīng)運(yùn)而生。蛋白質(zhì)組就是基因組所表達(dá)的所有蛋白質(zhì),即一種細(xì)胞、組織或生物體所擁有的全部蛋白質(zhì)。它的研究?jī)?nèi)容包括:(1)針對(duì)已有基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的生物體、組織或細(xì)胞,建立相應(yīng)蛋白質(zhì)組或亞蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)(蛋白質(zhì)表達(dá)譜)及其蛋白質(zhì)組連鎖群,即組成性蛋白質(zhì)組學(xué);識(shí)別執(zhí)行關(guān)鍵生命功能的多蛋白質(zhì)復(fù)合物并分析控制這些多蛋白質(zhì)復(fù)合物的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的特征;(2)以重要的生命過(guò)程或人類一些重大疾病為對(duì)象,進(jìn)行重要的生理和病理體系或過(guò)程的研究,即比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究;(3)蛋白質(zhì)組學(xué)支撐技術(shù)平臺(tái)和生物信息學(xué)的研究。目前,蛋白質(zhì)組學(xué)研究已在各個(gè)方面取得了重要進(jìn)展,如:蛋白質(zhì)和肽的分離方法研究;用于對(duì)蛋白質(zhì)和肽進(jìn)行定量的選擇標(biāo)記方法研究;翻譯后蛋白質(zhì)修飾的表征和相應(yīng)的快速、準(zhǔn)確分析儀器的研制;疾病診斷的生物標(biāo)志物及其治療的藥靶的選擇;藥物開發(fā)及代謝機(jī)理的研究、生理病理研究、環(huán)境對(duì)蛋白質(zhì)修飾的影響和疫苗的篩選等等。從蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容看出,要研究人類基因組的功能,首先需要對(duì)特定時(shí)空和特定環(huán)境條件下細(xì)胞、組織或生物活體中大約40000個(gè)基因所編碼的高出其數(shù)量2～3個(gè)數(shù)量級(jí)的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行識(shí)別和定量分析;其次還要對(duì)翻譯后蛋白質(zhì)的修飾(磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰基化等)和加工進(jìn)行分析,并對(duì)相似物進(jìn)行比較,以確定基因型與環(huán)境結(jié)合得到的表型。要完成如此巨大的工作量,目前的技術(shù)路線主要集中在高效、快速并便于自動(dòng)化的分離方法;高靈敏度、低檢測(cè)限、準(zhǔn)確和快速的鑒定方法以及完整、可靠并方便檢索的數(shù)據(jù)庫(kù)。一般用于蛋白質(zhì)研究的方法及技術(shù)路線如下:目前,用于“海量”蛋白質(zhì)混合物的高效分離方法主要有二維電泳和高效液相色譜兩種方法。其中因分離度高并具有直觀圖譜而被普遍采用的方法為二維電泳,即2DE方法。2DE與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中一個(gè)較為成熟的技術(shù)平臺(tái),被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的各個(gè)方面。但由于該技術(shù)伴隨其誕生所固有的缺陷(即:(1)在二維凝膠電泳圖譜上,并不是每個(gè)蛋白點(diǎn)所包含的蛋白量都足以用于鑒定蛋白;(2)存在歧視性問題,如對(duì)于低豐度蛋白、疏水性蛋白、極堿性蛋白(pI>10)、一些極大蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量>200000)和極小蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量<8000),二維凝膠電泳還不能夠?qū)⑵浜芎玫仫@示出來(lái),僅僅只有一些可溶的蛋白被用于研究;(3)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力,而且不容易自動(dòng)化),因此近幾年對(duì)該方法進(jìn)行了一些改進(jìn),如對(duì)電泳前生物樣品進(jìn)行預(yù)濃縮和預(yù)分離、分步提取以及對(duì)凝膠的染色過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化,但都未有實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展。為了解決這種方法存在的問題,另一種高效分離方法,即高效液相色譜方法(HPLC)獲得了愈來(lái)愈多的應(yīng)用,特別是各種模式色譜聯(lián)用組成多維色譜分離技術(shù)逐漸被采用,并與質(zhì)譜聯(lián)用以克服二維凝膠電泳存在的缺陷。通常與質(zhì)譜聯(lián)用的多維色譜分離方法是基于兩種或兩種以上不同分離機(jī)理方法的優(yōu)化和組合,其峰容量為最后一種模式色譜對(duì)前一種(或幾種)模式色譜分離所得的所有餾分進(jìn)一步分離的色譜峰的總和。分離方法的選擇除了根據(jù)分離對(duì)象和目的的不同考慮不同分離方法以及組合方式外,還應(yīng)考慮質(zhì)譜鑒定的要求以及最后從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的需要。由于蛋白質(zhì)組的龐大和復(fù)雜,通常需要對(duì)其進(jìn)行預(yù)分離以縮小分離范圍,再進(jìn)一步進(jìn)行高效分離。本文主要對(duì)蛋白質(zhì)組研究中常用的高效液相色譜分離與質(zhì)譜聯(lián)用方法的最新進(jìn)展進(jìn)行評(píng)述。1液-液-ms法在對(duì)生物大分子進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí),常用的兩種“軟”電離源為基質(zhì)輔助激光解吸電離源(MALDI)和電噴霧電離源(ESI)。為了使蛋白質(zhì)或肽混合物分離和鑒定能自動(dòng)進(jìn)行,一般將電噴霧源的質(zhì)譜或串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS或ESI-MS/MS)與nL(納升)級(jí)反相高效液相色譜(RP-HPLC)系統(tǒng)聯(lián)用,避免其他模式色譜(如離子交換色譜)將有害的鹽離子帶入質(zhì)譜系統(tǒng),增大系統(tǒng)噪聲,影響檢測(cè)靈敏度。這種聯(lián)用技術(shù)的出現(xiàn),使得對(duì)復(fù)雜體系的蛋白質(zhì)的在線分離和鑒定達(dá)到前所未有的高靈敏度(檢測(cè)濃度達(dá)10-15～10-18mol/L)和分析速度(分析蛋白質(zhì)速度達(dá)每天200～300種),借助于計(jì)算機(jī)的聯(lián)機(jī)檢索,使得對(duì)蛋白質(zhì)混合體系進(jìn)行高通量篩選和鑒定達(dá)到了很高的程度,不僅減少了對(duì)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)和費(fèi)力的二維凝膠電泳方法的依賴,還在此技術(shù)基礎(chǔ)上衍生出多種分離鑒定技術(shù),如一維凝膠分離鑒定技術(shù)、免疫親和沉淀-質(zhì)譜鑒定技術(shù),甚至直接對(duì)全細(xì)胞裂解液進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析。現(xiàn)在該技術(shù)已經(jīng)廣泛用于生物大分子相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定以及生物體、組織或細(xì)胞中蛋白質(zhì)組的研究,揭示生物體中蛋白質(zhì)種類、豐度的變化、修飾、降解等與生物體生理和病理之間的關(guān)系,為疾病預(yù)防和治療、新藥開發(fā)以及生命奧秘的認(rèn)識(shí)提供了一種可靠的技術(shù)平臺(tái)。其技術(shù)路線為:樣品(細(xì)胞、組織等)酶解→→酶解多肽混合物→RΡ-ΗΡLC→ΜS,ΜS/ΜS→RP?HPLC→MS,MS/MS序列、相對(duì)分子質(zhì)量等→計(jì)算機(jī)在線檢索→蛋白質(zhì)鑒定。在一維色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)中,一方面要考慮的是分離和質(zhì)譜鑒定條件的優(yōu)化,另一方面就是如何使用該技術(shù)解決實(shí)際問題。Shen等詳細(xì)討論了nL級(jí)規(guī)模的LC-MS中毛細(xì)管的內(nèi)徑、長(zhǎng)度、多孔與非多孔填料以及流速等對(duì)峰容量的影響,發(fā)現(xiàn)LC-MS系統(tǒng)對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)靈敏度隨上樣量的增大或隨流動(dòng)相流速的減小而增高,這對(duì)有限樣品量的蛋白質(zhì)組分析具有重要意義。他們還發(fā)現(xiàn)多孔與非多孔填料對(duì)多肽的質(zhì)量回收率沒有顯著影響,表明在選擇色譜填料時(shí)應(yīng)盡可能選擇高分離效率的多孔填料。當(dāng)然,反相高效毛細(xì)管色譜柱的裝填質(zhì)量也是蛋白質(zhì)組學(xué)分離技術(shù)中需要考慮的關(guān)鍵技術(shù)之一。另外,對(duì)ESI噴頭的孔徑也進(jìn)行了研究,結(jié)果表明該技術(shù)可靠,重現(xiàn)性好,靈敏度高,適合于做復(fù)雜樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。Vissers等還提出了一種流動(dòng)相流速可變的“峰阱”色譜接口技術(shù),可保證多肽混合物在分析柱上的完全分離、一級(jí)質(zhì)譜或串聯(lián)質(zhì)譜分析,不需要在進(jìn)行nL級(jí)LC-MS/MS分離鑒定時(shí)必須采用的分流技術(shù)。Laurell等評(píng)述了一種固定化酶切的樣品制備技術(shù),將這種技術(shù)與LC-MS聯(lián)用可使蛋白質(zhì)分析的自動(dòng)化程度和靈敏度更高。Zhang等對(duì)不同同位素標(biāo)記-反相高效液相色譜-質(zhì)譜法用于蛋白質(zhì)組定量中存在的問題進(jìn)行了研究,結(jié)果表明:由于標(biāo)記方法的不同,對(duì)標(biāo)記和未標(biāo)記的多肽混合物的分離度影響很大,因此對(duì)所定量的蛋白質(zhì)組的影響也很大。Premstaller等還制備了苯-二乙烯苯反相整體色譜柱。當(dāng)流動(dòng)相中的三氟乙酸含量從0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)～0.2%降低到0.05%后,與ESI-MS聯(lián)用,可測(cè)定多肽或蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量,檢測(cè)限可達(dá)fmol,準(zhǔn)確度達(dá)到50×10-6～150×10-6(50～150ppm)。除了對(duì)方法本身的研究外,對(duì)LC-MS方法在蛋白質(zhì)組學(xué)各個(gè)方面的應(yīng)用也進(jìn)行了廣泛的研究。Spahr等用LC-MS/MS(quadrupole-timeofflightMS,Q-TOF)對(duì)商業(yè)收集的男性尿進(jìn)行了4次分析,采集了1450個(gè)MS/MS譜圖,匹配了751個(gè)序列,鑒定了124種蛋白質(zhì)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)所用的時(shí)間少于采用二維凝膠電泳-質(zhì)譜分析該樣品時(shí)所消耗的時(shí)間,表明在混合物中鑒定出同樣種類的蛋白質(zhì)時(shí),該方法具有較高的效率。Cunsolo等將RP-HPLC-ESI-MS用于花粉中引起過(guò)敏的蛋白質(zhì)中二硫鍵的確定以及所含半胱氨酸氧化態(tài)的表征,為蛋白質(zhì)和多肽中二硫鍵的研究提供了一個(gè)新的方法。Shen等用在線LC-MS和LC-MS/MS研究了戒酒硫(一種戒酒藥物)治療酗酒的代謝途徑和代謝物,發(fā)現(xiàn)了藥物的作用位點(diǎn)和作用機(jī)理,為該藥物的有效利用提供了參考。LC-MS作為一維以及二維凝膠電泳技術(shù)的一個(gè)重要補(bǔ)充,可用于大腦中神經(jīng)肽的研究。神經(jīng)肽控制著大多數(shù)生物過(guò)程,但其相對(duì)分子質(zhì)量一般為300～5000,用二維凝膠電泳分離較為困難,而用LC-MS則比較容易。據(jù)報(bào)道,在所分析的老鼠大腦的某個(gè)確定區(qū)域中已經(jīng)鑒定出約1500個(gè)肽。利用LC-MS/MS方法可對(duì)蛋白質(zhì)相對(duì)定量方法進(jìn)行評(píng)估。首先用固相萃取技術(shù)提取混合物中同位素特異性標(biāo)記的半胱氨酸肽,然后對(duì)回收物進(jìn)行序列和相對(duì)含量的測(cè)定,比較了同位素編碼親和標(biāo)簽技術(shù)和穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù),表明后者更簡(jiǎn)單、高效和靈敏。該方法還可用于磷酸化的多肽分析。首先將多肽混合物進(jìn)樣到一個(gè)內(nèi)填C18反相色譜填料、內(nèi)徑為75μm的毛細(xì)管中,梯度洗脫后直接用離子阱質(zhì)譜儀或四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測(cè)。一般流動(dòng)相流速為100～200nL/min,峰的洗脫時(shí)間持續(xù)10～30s,可以分離并鑒定數(shù)以千計(jì)的多肽。Coutre等還開發(fā)了一種HPLC-ESI-MS技術(shù),直接測(cè)定了4種不同膜蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量,最高相對(duì)分子質(zhì)量為61000,準(zhǔn)確度達(dá)到±0.01%。該技術(shù)的主要特點(diǎn)是可以鑒定未知蛋白而無(wú)需予先對(duì)其分離純化。為了進(jìn)一步提高分離能力,可首先將樣品提取液進(jìn)行自由流毛細(xì)管等電聚焦電泳預(yù)分離,然后進(jìn)行SDS(sodiumdodecylsulphate-polyacylamidegelelectrophoresis)分離,再經(jīng)過(guò)RP-HPLC-MS分離鑒定。該方法不但具有非常高的分離效率,而且不受樣品量的限制,并能用于蛋白質(zhì)復(fù)合物的研究,為蛋白質(zhì)組學(xué)用于細(xì)胞圖譜研究提供了強(qiáng)有力的工具。另外,將反相毛細(xì)管液相色譜與高靈敏度、高分離度和高準(zhǔn)確度的傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FTICR)聯(lián)用,可以用準(zhǔn)確質(zhì)量標(biāo)簽的方法一次表征100000個(gè)肽混合物,其肽的質(zhì)量準(zhǔn)確度達(dá)1×10-6。該技術(shù)不但能進(jìn)行大規(guī)模的蛋白質(zhì)鑒定,而且沒有“歧視性”,并能用于穩(wěn)定同位素方法準(zhǔn)確測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度。在對(duì)生物大分子樣品進(jìn)行分析時(shí),也可以通過(guò)RP-HPLC分離提取后,收集各個(gè)組分,用MALDI-MS測(cè)定不同蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量;然后再將含有生物標(biāo)記物的餾分進(jìn)行酶解,用MS/MS對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行鑒定。從一維色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展看出,對(duì)于不很復(fù)雜的體系,該技術(shù)可充分發(fā)揮快速、靈敏以及便于自動(dòng)化的特色,它是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中值得重視的、簡(jiǎn)便的方法之一。2二維鉻ct與質(zhì)量分析的聯(lián)合技術(shù)2.1多維質(zhì)譜鑒定技術(shù)對(duì)于簡(jiǎn)單的生物大分子混合物,利用一維色譜分離技術(shù)可以達(dá)到分離的要求,但對(duì)于復(fù)雜的多肽混合物往往不能滿足分離的需要,這使人們想到多維色譜分離方法。其中的一個(gè)方法是根據(jù)電荷和疏水性差異,對(duì)蛋白質(zhì)混合物酶解所得的復(fù)雜多肽混合物進(jìn)行離子交換色譜分離后,對(duì)收集的餾分再進(jìn)行反相液相色譜分離,并通過(guò)MS/MS對(duì)多肽進(jìn)行序列分析,最后在計(jì)算機(jī)上利用一種數(shù)學(xué)算法對(duì)所獲得的序列與從基因組翻譯的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較,確定出多肽所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)。一般的分析技術(shù)路線為:樣品(細(xì)胞、組織等)Τrypsin酶解→多肽混合物進(jìn)樣→SCX陽(yáng)離子色譜柱(第一維色譜:強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜分離,階梯梯度洗脫)強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜餾分進(jìn)樣→RΡ-ΗΡLC(第二維色譜:RP-HPLC分離,線性梯度洗脫)RΡ-ΗΡLC分離餾分進(jìn)樣→ΜS,ΜS/ΜS(多肽序列分析)→計(jì)算機(jī)檢索(鑒定混合物中的蛋白質(zhì))。但Yates研究組所提出的多維色譜分離-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定技術(shù)與上述的技術(shù)路線稍有差別。他們是將不同分離模式的色譜柱以串聯(lián)分離的方式合并于同一色譜柱中進(jìn)行,即在同一色譜柱的前部分裝填強(qiáng)陽(yáng)離子色譜填料,后部分裝填反相液相色譜填料。該方法已被成功地用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究,并被稱為多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)(multidimensionalproteinidentificationtechnology,MudPIT),獲得了廣泛應(yīng)用,并被詳細(xì)評(píng)述。該方法首先對(duì)變性和還原的蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行酶解得到多肽混合物,然后調(diào)節(jié)混合物的pH<3,進(jìn)樣到強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜柱,以階梯方式增加鹽的濃度,依次將某一餾分直接洗脫并進(jìn)樣到反相液相色譜柱上,洗脫除鹽后,線性增加乙腈濃度,對(duì)在反相液相色譜柱上保留的組分進(jìn)行梯度洗脫分離,用MS/MS對(duì)分離的餾分進(jìn)行鑒定,得到不同多肽的序列,最后用SEQUEST算法從基因組翻譯的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索,查找確定與多肽序列相匹配的蛋白質(zhì)。重復(fù)從強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜分離到計(jì)算機(jī)檢索步驟,就可對(duì)全細(xì)胞裂解液進(jìn)行分析。由于該技術(shù)是將強(qiáng)陽(yáng)離子和反相液相色譜填料依次裝填在一個(gè)納噴進(jìn)樣針中,而且一個(gè)分析周期可檢測(cè)100多種蛋白質(zhì),所以該方法可對(duì)樣品量較少的蛋白質(zhì)進(jìn)行快速分析,適用于蛋白質(zhì)組學(xué)中大規(guī)模蛋白質(zhì)的分離鑒定。利用該方法已經(jīng)鑒定出啤酒酵母和人的核糖體中新的蛋白質(zhì),并鑒定出了啤酒酵母中1484個(gè)蛋白質(zhì)。在對(duì)細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行定性分析的同時(shí),對(duì)其進(jìn)行的定量研究也在蓬勃開展。Washburn等將代謝標(biāo)記和MudPIT用于啤酒酵母中蛋白動(dòng)態(tài)范圍的研究便是一例。他們首先對(duì)啤酒酵母菌株在富含14N或15N的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng),然后將兩者的裂解液按1∶1,5∶1和10∶1比例混合并酶解成多肽混合物,用MudPIT分析上述3個(gè)混合物中的蛋白質(zhì)組,獲得了準(zhǔn)確、可靠的結(jié)果,表明該方法可用于一系列微生物,甚至哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)體系蛋白質(zhì)組的定量研究。由于MudPIT技術(shù)不容易在一維色譜-質(zhì)譜和二維色譜-質(zhì)譜之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換以滿足不同復(fù)雜程度樣品的分離鑒定,而對(duì)大量簡(jiǎn)單的樣品也無(wú)須采用此復(fù)雜技術(shù),于是Davis等設(shè)計(jì)了一種比較簡(jiǎn)單的多維色譜-質(zhì)譜分離鑒定技術(shù)平臺(tái)。其基本思想就是將進(jìn)樣、離子交換色譜、預(yù)柱、反相液相色譜和質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)用3個(gè)六通閥連接起來(lái),可以進(jìn)行一維或二維色譜分離,并可進(jìn)行自動(dòng)或手動(dòng)進(jìn)樣。該技術(shù)具有高的分離效率和分析通量,可用于細(xì)胞內(nèi)、外的蛋白質(zhì)復(fù)合物和亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的研究。由此可得出,針對(duì)不同的研究目的和對(duì)象,應(yīng)不斷開發(fā)新的多維色譜-質(zhì)譜技術(shù),以滿足蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的需要。2.2微量磷酸肽檢測(cè)和鑒定用親和色譜柱對(duì)某一類具有特異性親和力的蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行提取,然后進(jìn)行LC-MS或MS/MS鑒定,確定出蛋白質(zhì)的種類和修飾位點(diǎn),其基本技術(shù)路線與“2.1”節(jié)中的分析技術(shù)路線類似。這種方法對(duì)研究翻譯后蛋白質(zhì)修飾,特別是磷酸化蛋白質(zhì)組的研究具有重要意義。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的磷酸化修飾是生物體內(nèi)最重要的共價(jià)修飾方式之一。在人類基因組中,有2%的基因編碼了參與蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化過(guò)程的蛋白激酶和磷酸(酯)酶,基因編碼的所有蛋白中大約有30%的蛋白質(zhì)發(fā)生過(guò)磷酸化修飾,大多數(shù)細(xì)胞生命過(guò)程的調(diào)節(jié)都與蛋白質(zhì)分子中的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上可逆磷酸化修飾有關(guān)。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化這一可逆過(guò)程調(diào)節(jié)著包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)活動(dòng)、肌肉收縮及腫瘤發(fā)生等過(guò)程在內(nèi)的幾乎所有生命活動(dòng)。因此,蛋白質(zhì)磷酸化修飾的研究是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中一個(gè)非常重要的方面。Ficarro等將固定化金屬親和色譜(IMAC)柱與反相高效液相色譜(RP-HPLC)柱聯(lián)用構(gòu)成IMAC-RP-HPLC二維色譜系統(tǒng),并與電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜在線聯(lián)用,對(duì)磷酸肽進(jìn)行親和提取、分離純化和位點(diǎn)分析,提出了一個(gè)很有希望的微量磷酸肽檢測(cè)和鑒定的方法。該方法首先將酵母細(xì)胞裂解液中磷酸化和非磷酸化的蛋白混合物酶解后,對(duì)羧酸基進(jìn)行甲基化修飾,直接用固定化金屬親和色譜富集磷酸肽,再通過(guò)納噴反相高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析,鑒定出1000多種磷酸化肽。在216個(gè)磷酸化肽中確定出383個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中60個(gè)磷酸化肽為單位點(diǎn)修飾,145個(gè)為雙位點(diǎn)修飾,11個(gè)為三位點(diǎn)修飾。而且,這種方法很容易發(fā)展成對(duì)差異表達(dá)的磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行顯示和定量測(cè)定的方法。另外,也可對(duì)含有磷酸氨基酸殘基的多肽進(jìn)行化學(xué)修飾或生物素標(biāo)記,再通過(guò)裝填抗生物素鍵合填料親和色譜柱進(jìn)行純化和MS/MS序列分析,確定出磷酸化蛋白和磷酸化位點(diǎn)。有關(guān)多維色譜-質(zhì)譜鑒定技術(shù)在確定磷酸化蛋白質(zhì)以及磷酸化位點(diǎn)的應(yīng)用,Mann等做了全面的評(píng)述。在蛋白質(zhì)和多肽的糖基化研究中,親和色譜-反相液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)也具有潛力。Geng等用該方法研究人血清和癌細(xì)胞中的糖基化蛋白質(zhì)。其步驟為:(1)還原和烷基化;(2)對(duì)所有蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行胰蛋白酶水解;(3)用固定化凝集素親和色譜柱對(duì)糖肽進(jìn)行選擇提取;(4)糖肽餾分直接進(jìn)樣到反相液相色譜柱,然后進(jìn)行梯度洗脫分離;(5)MALDI-MS鑒定反相液相色譜收集的色譜峰餾分;(6)根據(jù)肽質(zhì)量譜進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。所分析的糖蛋白包括:(1)已知一級(jí)結(jié)構(gòu)的N型糖蛋白;(2)未知結(jié)構(gòu)的N型糖蛋白;(3)用單N-乙酰氨基葡萄糖糖基化的O型糖蛋白。復(fù)雜混合物中多肽的鑒定可以通過(guò)C-端羧酞酶測(cè)序或通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白比較色譜行為和質(zhì)量進(jìn)行確定。該方法的優(yōu)點(diǎn)是能快速確定糖蛋白的類型,缺點(diǎn)是無(wú)法區(qū)分糖基化異構(gòu)體。另外,親和色譜與質(zhì)譜聯(lián)用可以分析蛋白質(zhì)復(fù)合物,同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。Shevchenko等研究了芽殖酵母中蛋白質(zhì)的相互作用情況。他們首先對(duì)53個(gè)基因的抗原決定簇進(jìn)行標(biāo)記,然后對(duì)全細(xì)胞裂解液中的相互作用物進(jìn)行兩步免疫親和色譜分離和鑒定。用38個(gè)誘餌蛋白提取了屬于19個(gè)不同功能蛋白復(fù)合物的220種蛋白質(zhì);鑒定出一個(gè)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中4個(gè)蛋白質(zhì)被不同功能蛋白復(fù)合物所共享。由于該方法所得結(jié)果與基因組中廣泛使用的雙雜交方法所得結(jié)果的一致性僅為14%,所以,在蛋白質(zhì)組研究中,親和色譜-質(zhì)譜方法應(yīng)為雙雜交方法的一個(gè)重要補(bǔ)充。Sanders等還用多克隆抗體純化-多維色譜-質(zhì)譜技術(shù)研究了轉(zhuǎn)錄因子(TFIID)的作用機(jī)理。由于TFIID是TBP(TATA-bindingprotein,TBP)和與TBP有關(guān)的14種不同因子組成的多亞單位復(fù)合體,所以他們首先用多克隆抗體與每個(gè)亞單位作用,免疫純化TFIID,然后用多維色譜-質(zhì)譜技術(shù)鑒定與TBP有關(guān)的蛋白質(zhì),鑒定了許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物,并對(duì)其進(jìn)行了詳細(xì)的表征。Bures等用脫水胰蛋白酶色譜柱從野生型老鼠和羧肽酶缺失型老鼠(CpE)的神經(jīng)內(nèi)分泌組織中提取帶有堿性C-端的多肽,對(duì)它們進(jìn)行液相色譜分離和質(zhì)譜鑒定,表明親和色譜-反相液相色譜-質(zhì)譜方法對(duì)正常和變異老鼠差異多肽的研究具有可行性。先天性糖基化病會(huì)使血清中碳水化合物缺失的轉(zhuǎn)鐵蛋白異構(gòu)體(CDT)增加。為了將CDT從糖基化的轉(zhuǎn)鐵蛋白中分離出來(lái),Lacey等提出了在線免疫親和柱-C4反相液相色譜柱-質(zhì)譜方法,對(duì)血清稀釋液進(jìn)行分離鑒定,不但所需樣品量少、靈敏度和分離度高,而且分析速度快,可實(shí)現(xiàn)每天分析100個(gè)樣品的高通量分析。2.3色譜聚焦分離的可行性在用離子交換色譜對(duì)生物大分子進(jìn)行分離時(shí),既可采用鹽梯度洗脫,也可采用pH梯度洗脫。但在實(shí)驗(yàn)中,人們常常采用鹽梯度洗脫,而較少采用pH梯度洗脫。由于選擇pH梯度對(duì)生物大分子混合物進(jìn)行分離是基于生物大分子電荷和pI的不同,這與等電聚焦電泳的原理相似。等電聚焦電泳對(duì)生物大分子的成功分離已有幾十年的歷史,那么在離子交換色譜中進(jìn)行pH梯度分離時(shí)是否具有“聚焦”作用,可否達(dá)到等電聚焦電泳所具有的分離度和實(shí)驗(yàn)可操作性?Sluyterman等從理論上對(duì)色譜聚焦的原理進(jìn)行了分析,并用實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證,表明色譜聚焦不但可行,而且能達(dá)到等電聚焦電泳同樣的分離效率。與離子交換色譜分離采用的pH梯度洗脫的差異是:色譜聚焦分離是在離子交換劑的表面形成pH梯度,而不是在流動(dòng)相中形成pH梯度。色譜聚焦的裝置簡(jiǎn)單,易于操作,并能與反相液相色譜和質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)在線聯(lián)用,其技術(shù)路線與“2.1”節(jié)中的技術(shù)路線基本相同。Chong等已經(jīng)成功地將色譜聚焦分離與裝填非多孔色譜填料的反相液相色譜分離聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于人乳腺上皮細(xì)胞裂解液中蛋白質(zhì)的分離,并用ESI-TOF質(zhì)譜進(jìn)行了在線分析。該方法的特點(diǎn)是容易進(jìn)行自動(dòng)化操作,并能制作出包含pI和相對(duì)分子質(zhì)量、類似于二維電泳的蛋白質(zhì)圖譜,因此,提供了一種新的