發(fā)酵私曲中一個(gè)毛霉蛋白酶的分離純化及水解特性研究

發(fā)酵私曲中一個(gè)毛霉蛋白酶的分離純化及水解特性研究

毛霉菌是植物發(fā)酵和闡明的主要細(xì)菌之一。它的主要作用是以多媒體形式存在的，具有很高的脫水水平，并從含有各種生理活性的多媒體產(chǎn)品中分離出許多獨(dú)特的酋長。對(duì)許多腐敗產(chǎn)品的感官分析還表明，腐敗產(chǎn)品通常不具有一般蛋白水分解的獨(dú)特味道。如上所述，毛霉酶對(duì)解決植物蛋白（尤其是大豆蛋白）的低水分解和產(chǎn)物的強(qiáng)烈苦味方面具有很大的潛力。毛霉雖然在工業(yè)生產(chǎn)中有很悠久的應(yīng)用歷史,但是對(duì)這類菌種胞外蛋白酶系的研究卻并未完全展開.僅有少數(shù)學(xué)者對(duì)該菌種的發(fā)酵產(chǎn)酶特性以及粗酶的催化、水解特性進(jìn)行過探討.然而,毛霉長期受到高蛋白環(huán)境條件的馴化,通常具有合成及分泌多種胞外蛋白酶的能力,其胞外的蛋白酶系是由多種蛋白酶所構(gòu)成的復(fù)雜體系,因此,單純從總體上(即粗酶的研究)并不能完全了解其內(nèi)在的特性.為了更加全面地了解這一蛋白酶系的組分構(gòu)成、各組分的催化特性以及相互之間的作用,筆者開展了這方面的研究工作.1材料和方法1.1蛋白質(zhì)及氨基酸雅致放射毛霉ActinomucorelegansAS3.2778為華南理工大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種.二乙氨乙基(DEAE)-葡聚糖、羧甲基(CM)-葡聚糖、苯基-葡聚糖、葡聚糖6B購自Pharmacia公司;Alcalase及Protamex蛋白酶購自NovoNordisk公司;木瓜蛋白酶購自MERCK公司;大豆分離蛋白(SPI,蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為87.35%)購自哈爾濱高科大豆食品有限公司;其他試劑均為分析純或生化試劑.1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1蛋白峰的提取(1)粗酶的提取.稱取一定量的干麩曲加入10倍于其質(zhì)量的0.3mol/L的氯化鈉溶液,混勻后于40℃水浴中抽提1.5h,紗布過濾后在4℃以7000g離心10min,取上清液即得到粗酶液.(2)硫酸銨分段鹽析.取一定體積的粗酶液,在冰水浴中緩慢加入固體硫酸銨至飽和度為40%,充分溶解后在4℃冰箱中靜置4h,于4℃、12000g離心20min,取上清液繼續(xù)加入固體硫酸銨至飽和度為85%,4℃冰箱中靜置過夜,然后于4℃、12000g離心20min,蛋白沉淀用0.02mol/L、pH=7.5的Tris-HCl緩沖液溶解,并透析脫鹽.(3)DEAE-葡聚糖陰離子交換.用0.02mol/L、pH=7.5的Tris-HCl緩沖液平衡DEAE-葡聚糖陰離子交換柱,取一定量鹽析脫鹽后的酶液,加樣于陰離子交換柱.用平衡緩沖液充分洗柱,然后混合A液(0.02mol/L、pH=7.5的Tris-HCl緩沖液)和B液(0.5mol/LNaCl溶液,即NaCl溶于0.02mol/L、pH=7.5的Tris-HCl緩沖液)進(jìn)行梯度洗脫,收集穿透蛋白峰.用超濾離心管濃縮收集液并用0.05mol/L、pH=5.0的醋酸緩沖液調(diào)節(jié)其pH值至5.0.(4)CM-葡聚糖陽離子交換.用0.05mol/L、pH值為5.0的醋酸緩沖液平衡CM-葡聚糖陽離子交換柱,取上一步的濃縮酶液加樣于陽離子交換柱.用平衡緩沖液充分洗柱,然后用A液(0.05mol/L、pH值為5.0的醋酸緩沖液)和B液(0.5mol/L的NaCl溶液,NaCl溶于0.05mol/L、pH值為5.0的醋酸緩沖液制得)混和進(jìn)行梯度洗脫.收集第一洗脫峰(即目標(biāo)蛋白峰),用超濾離心管濃縮收集的酶液.(5)苯基-葡聚糖疏水層析.用1.2mol/L的硫酸銨溶液(硫酸銨溶于0.05mol/L、pH值為7.5的磷酸鹽緩沖液)平衡苯基-葡聚糖疏水層析柱.上一步的濃縮酶液與2.4mol/L硫酸銨溶液(硫酸銨溶于0.1mol/L、pH值為7.5的磷酸鹽緩沖液)等體積混和后加樣于苯基-葡聚糖疏水層析柱,用平衡緩沖液充分沖洗疏水柱,然后用A液(0.05mol/L、pH值為7.5的磷酸鹽緩沖液)和B液(1.2mol/L的硫酸銨溶液,即硫酸銨溶于0.05mol/L、pH值為7.5的磷酸鹽緩沖液)混和進(jìn)行梯度洗脫.收集梯度洗脫的第二蛋白峰,即為目標(biāo)蛋白峰.用超濾離心管濃縮收集的酶液.(6)葡聚糖6B凝膠過濾層析.用0.02mol/L、pH=7.5的磷酸鹽緩沖液平衡葡聚糖6B凝膠柱,將上述濃縮酶液加樣于凝膠柱,用0.02mol/L、pH=7.5的磷酸鹽緩沖液洗脫.收集主要蛋白峰即為目標(biāo)蛋白,用超濾離心管濃縮收集樣品即得純化酶液.1.2.2e電泳分析利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)檢測(cè)了純化后的蛋白酶純度,并通過還原及非還原電泳的比較,確定該蛋白酶的亞基組成.電泳分析采用了Laemmli方法,分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%,濃縮膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%.1.2.3大豆蛋白水解度的測(cè)定以大豆蛋白為底物,考察了純化的毛霉蛋白酶對(duì)大豆蛋白的水解效果,并探討了相關(guān)因素對(duì)水解過程的影響.(1)水解試驗(yàn).用0.05mol/L、pH值為8.0的磷酸鹽緩沖液配制5%的大豆分離蛋白,在沸水浴中熱處理15min.冷卻后按酶活與底物比5.0U/g(1U=16.67nmol/s)加入蛋白酶,然后置于50℃水浴條件下酶解,測(cè)定大豆蛋白水解度的變化.(2)pH值對(duì)水解的影響.分別在pH值為6.0、8.0、10.0的條件下進(jìn)行水解試驗(yàn),探討毛霉蛋白酶在不同pH條件下對(duì)大豆蛋白的水解情況.(3)溫度對(duì)水解的影響.分別在45、55、65℃的條件下進(jìn)行水解試驗(yàn),考察毛霉蛋白酶在不同溫度下對(duì)大豆蛋白的水解情況.(4)加酶量對(duì)水解的影響.分別以酶活和底物比為2.5、5.0、7.5U/g加入不同量的蛋白酶進(jìn)行酶解,考察了加酶量對(duì)大豆蛋白水解的影響.(5)不同蛋白酶對(duì)大豆蛋白的水解.比較了純化的毛霉蛋白酶、粗酶液、木瓜蛋白酶、Alcalase堿性蛋白酶及Protamex復(fù)合蛋白酶對(duì)大豆蛋白水解效率的差異.在pH值為8.0、50℃的條件下,以酪蛋白為底物統(tǒng)一校準(zhǔn)以上幾種蛋白酶的酶活單位,然后按照標(biāo)準(zhǔn)水解試驗(yàn)的方法進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn),水解5h后測(cè)定大豆蛋白的水解度.1.2.4游離氨基測(cè)定水解度的測(cè)定采用甲醛滴定法.取5mL水解樣品,加入60mL蒸餾水,用0.1000mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)pH值到8.2,加入20mL己中和的甲醛,然后用0.1000mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到pH值為9.2,記錄消耗的NaOH溶液的體積V1.用蒸餾水代替樣品,操作方法相同,測(cè)得空白對(duì)照體積V0.設(shè)樣品中游離氨基的量為C,樣品水解度為D,則式中:ρ為樣品中蛋白質(zhì)量濃度,g/L;0.1000為NaOH溶液的濃度,mol/L;5為水解樣品的體積,mL;0.33是大豆蛋白中游離氨基濃度,mmol/g;7.8為每克大豆蛋白的肽鍵當(dāng)量數(shù),mmol/g;1000為用于單位換算的量.1.2.5酪氨酸酶活測(cè)定蛋白質(zhì)濃度和蛋白酶酶活測(cè)定分別采用Bradford法和Folin酚法.在1.5mL離心管中加入0.3mL適當(dāng)稀釋的酶液及0.3mL1.5%的酪蛋白溶液(酪蛋白溶于0.02mol/L,pH值為9.5的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中),40℃反應(yīng)10min,再加0.6mL0.4mol/L的三氯乙酸終止反應(yīng),靜置15min后于14000g離心10min,取上清液0.6mL,加入3mL0.4mol/L的碳酸鈉溶液及0.6mL福林酚試劑,于40℃顯色20min,在680nm處測(cè)其吸光度D(680),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活.酶活定義:實(shí)驗(yàn)條件下,每分鐘水解酪蛋白釋放1μmol當(dāng)量酪氨酸所需的酶量定義為1個(gè)活力單位,即1U.1.2.6膠片電泳酶譜檢測(cè)參考OlafTill的方法.采用非熱變性的SDS電泳,其分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%(其中添加0.1%的牛血清白蛋白作為底物),濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%.樣品與上樣緩沖液混和后直接點(diǎn)樣于各泳道,在冰水浴中進(jìn)行電泳.電泳結(jié)束后用2.5%Triton-X100(溶于0.05mol/L、pH值為9.5的甘氨酸-NaOH緩沖液制得)浸洗膠片兩次,每次20min,然后用0.05mol/L、pH值為9.5的甘氨酸-NaOH緩沖液多次清洗,置于0.05mol/L、pH值為9.5的甘氨酸-NaOH緩沖液中于40℃酶解過夜.用考馬斯亮藍(lán)染色的方法對(duì)酶解后的膠片進(jìn)行染色及脫色.2結(jié)果與分析2.1電泳分離和純化蛋白酶純化結(jié)合多種層析方法對(duì)毛霉蛋白酶組分進(jìn)行純化.首先,采用陰離子交換的方法對(duì)毛霉粗酶液中蛋白酶組分進(jìn)行分組分離(見圖1),使其中的堿性蛋白酶組分主要分布于穿透峰中,而其它蛋白酶組分及雜蛋白則被樹脂所吸附;隨后,利用CM-葡聚糖陽離子交換柱對(duì)穿透峰中的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的分組分離(見圖2),通過優(yōu)化洗脫方法使蛋白酶組分與絕大多數(shù)的雜蛋白分離開;然后,利用目標(biāo)蛋白與雜蛋白疏水性的不同,采用疏水層析柱對(duì)上一步收集的樣品進(jìn)行進(jìn)一步的分離(見圖3);最后利用目標(biāo)蛋白與雜蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的差異做進(jìn)一步純化(見圖4),并同時(shí)達(dá)到對(duì)樣品脫鹽的目的.采用SDS電泳的方法對(duì)純化后樣品的純度進(jìn)行分析(見圖5)顯示,純化后的蛋白酶在SDS中僅顯示出單一條帶,說明該蛋白酶組分已經(jīng)達(dá)到電泳純;電泳還發(fā)現(xiàn)在還原及非還原條件下純化的毛霉蛋白酶均顯示出單一條帶,這說明純化的毛霉蛋白酶是一單體蛋白,其相對(duì)分子質(zhì)量大約為32000.表1中的純化過程及結(jié)果顯示,經(jīng)過以上多步的純化操作,毛霉蛋白酶的純度提高了22.7倍,其最終比酶活為30.47U/mg,酶活回收率為16.10%.2.2粗酶及純化蛋白酶的組分分析酶譜是一種將電泳分離與在位酶活檢測(cè)相結(jié)合起來的檢測(cè)方法.它在檢測(cè)及分析明膠酶、金屬蛋白酶、果膠酶、脂肪酶等水解酶方面有著廣泛的應(yīng)用.本研究中,采用酶譜的方法分析了粗酶及純化蛋白酶的組分.由圖6可以看出,原粗酶液在電泳膠片上可以清晰地顯示出3個(gè)不同的水解條帶,而純化后的酶液僅顯示出其中的一條,由此說明在原粗酶中至少存在有3個(gè)不同的蛋白酶組分,純化的蛋白酶僅為其中的組分之一.此外,從電泳膠片上水解條帶的亮度及粗細(xì)程度不難看出,原粗酶液中3個(gè)組分的含量及活性水平存在很大差異,被分離純化出的蛋白酶是其中的主要組分,另兩個(gè)組分的含量相對(duì)較低.2.3酸性蛋白酶.圖7的結(jié)果顯示,純化的毛霉蛋白酶在堿性條件下(pH值為8.0～10.0)對(duì)大豆蛋白表現(xiàn)出相對(duì)較強(qiáng)的水解能力,說明該酶是一種堿性蛋白酶.以大豆蛋白為底物,其合適的催化pH值在10.0左右.在pH值為6.0的條件下,該蛋白酶顯示出很弱的水解能力,說明該蛋白酶在pH值為6.0時(shí)的活性很低.而腐乳釀造過程中,其蛋白水解反應(yīng)通常是在pH=5.5～6.5的條件下進(jìn)行的.由此可見,純化的蛋白酶在腐乳釀造過程中并不是起主要作用的組分,這也說明了在毛霉胞外還有其它對(duì)腐乳釀造起重要作用的蛋白酶組分存在.2.4蛋白質(zhì)的純化分別于45、55、65℃的條件下進(jìn)行大豆蛋白的水解試驗(yàn),水解曲線如圖8所示.在不同的溫度下大豆蛋白的水解呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì).在55℃的條件下,純化的毛霉蛋白酶對(duì)大豆蛋白具有最高的水解活性,催化活性最強(qiáng);在65℃的條件下,大豆蛋白的水解度在前30min增加迅速,而后幾乎是維持不變,說明該蛋白酶在65℃也具有相當(dāng)強(qiáng)的活性,但在這一溫度下極不穩(wěn)定,很快就變性失活.2.5酶活對(duì)大豆蛋白水解度的影響如圖9所示,純化的毛霉蛋白酶的添加量對(duì)其水解大豆蛋白具有很顯著的影響,加酶量為2.5U/g時(shí),大豆蛋白的最大水解度為8.25%;當(dāng)加酶量增加到7.5U/g時(shí),大豆蛋白的水解度可以達(dá)到17.23%.在本實(shí)驗(yàn)中大豆蛋白水解度隨酶活的增加量遠(yuǎn)高于其它已報(bào)道的蛋白酶,如Alcalase、Protamex等.從大豆蛋白的水解過程來看,特定蛋白酶對(duì)大豆蛋白的最大水解度是一確定值,這主要是由該蛋白酶在大豆蛋白肽鏈上的切割位點(diǎn)所決定的;通常情況下進(jìn)行的水解反應(yīng)均不能達(dá)到這一最大水解度,其原因主要是由于水解過程中生成的小肽對(duì)蛋白酶有競爭抑制作用.一般來說,當(dāng)?shù)鞍酌傅挠昧吭黾訒r(shí),底物蛋白的水解度往往會(huì)有一定程度的增加,而增加程度的大小則主要依賴于可被作用底物的濃度,即底物肽鏈上可被切割位點(diǎn)的總量.由此可知:與其它蛋白酶相比,純化的毛霉蛋白酶具有更為廣泛的肽鍵選擇性,在大豆蛋白肽鏈上具有相對(duì)較多的切割位點(diǎn).2.6不同蛋白酶的肽鍵選擇性對(duì)復(fù)合酶的影響比較了不同蛋白酶對(duì)大豆蛋白的水解效果.實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):在測(cè)試的幾種蛋白酶中,毛霉粗酶液對(duì)大豆蛋白具有最強(qiáng)的水解能力,在實(shí)驗(yàn)條件下大豆蛋白的水解度可以達(dá)到23.50%,這應(yīng)該與毛霉胞外復(fù)雜的蛋白酶組成有密切的關(guān)系.眾多的研究已經(jīng)表明,多種蛋白酶的協(xié)同作用效果往往優(yōu)于單一蛋白酶.這主要是因?yàn)椴煌鞍酌傅碾逆I選擇性通常存在一定的差異,所以由它們構(gòu)成的復(fù)合酶具有一定的底物互補(bǔ)性,在底物蛋白肽鏈上有更多的作用位點(diǎn),表現(xiàn)出來的協(xié)同水解能力更強(qiáng).與其它幾種商品化的蛋白酶相比,純化的毛霉蛋白酶也顯示出相對(duì)較強(qiáng)的水解能力,在實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)大豆蛋白的水解度可以達(dá)到14%左右,而Alcalase和Protamex則只能達(dá)到10%左右,木瓜蛋白酶對(duì)大豆蛋白的水解度只能達(dá)到7%左右.這一結(jié)果表明,純化的毛霉蛋白酶對(duì)大豆蛋白具有相對(duì)較強(qiáng)的親和力,在大豆蛋白肽鏈上具有較多的酶切位點(diǎn),這進(jìn)一步說明了該蛋白酶組分具有相當(dāng)廣泛的肽鍵選擇性,與2.5中的結(jié)論相吻合.3其它蛋白酶本研究主要探討了一種毛霉堿性蛋白酶組分的分離及純化,利用多種層析相結(jié)合的方法從雅致放射毛霉AS3.2778的發(fā)酵麩曲中純化出一種蛋白酶組分,并以大豆蛋白為底物探討了該蛋白酶對(duì)大豆蛋白的水解效果.結(jié)果表明:該蛋白酶是一堿性蛋白酶,其作用的pH范圍相對(duì)較寬,在pH值為8.0～10.0時(shí)對(duì)大豆蛋白具有較強(qiáng)的水